羅宇婕, 汪 洋, 周 瓊, 何 杰, 李 幸

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410081)

植物不僅可以為昆蟲提供食物,還為其提供繁衍場(chǎng)所,對(duì)昆蟲生存有著重要意義(Olssonetal., 2005)。植物的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)可以調(diào)節(jié)植物和昆蟲之間的關(guān)系(de Moraesetal., 2001),有助于昆蟲尋找食物以及產(chǎn)卵場(chǎng)所(Byersetal., 1985; Showler, 2001)。觸角是昆蟲的重要嗅覺器官,而嗅覺是昆蟲感受外界刺激并產(chǎn)生選擇食物、求偶、交配及產(chǎn)卵等各種行為的基礎(chǔ)之一,對(duì)其種群生存和繁衍有重要作用(Ngumbietal., 2009; Zhangetal., 2015; Gadenneetal., 2016)。植食性昆蟲可以通過(guò)靈敏的嗅覺系統(tǒng),感受寄主植物產(chǎn)生的化學(xué)信息,并產(chǎn)生趨向寄主植物的行為反應(yīng)(杜永均和嚴(yán)福順, 1994)。昆蟲產(chǎn)卵前先定位寄主植物及其棲息地的位置,再選擇合適的寄主植物產(chǎn)卵,寄主植物揮發(fā)物在昆蟲尋找產(chǎn)卵場(chǎng)所的過(guò)程中起重要作用(Renwick, 1989; Hanks, 1999; 張文璐等, 2018)。因此,研究寄主植物揮發(fā)物對(duì)昆蟲觸角電位(electroantennogram, EAG)、以及趨向行為和產(chǎn)卵選擇行為的影響,對(duì)害蟲的防治和益蟲的利用具有重要指導(dǎo)意義。

玉帶鳳蝶Papiliopolytes隸屬于鳳蝶科(Papilionidae)鳳蝶屬Papilio,寡食性,幼蟲主要以蕓香科(Rutaceae)柑橘屬Citrus植物葉片為食,是柑橘類果樹的重要害蟲。玉帶鳳蝶成蟲產(chǎn)卵于柑橘嫩葉及嫩梢端部,孵化的幼蟲取食葉片為害,危害嚴(yán)重時(shí)僅留枝干(吳平輝等, 2006; 尹小剛等, 2015)。該蟲在我國(guó)的兩河流域至臺(tái)灣、海南等19個(gè)省份均有分布,長(zhǎng)江以北地區(qū)一般為每年發(fā)生3～4代,年平均溫度較高地區(qū)每年則可發(fā)生5～6代,均以蛹越冬(葉黎紅等, 2008),國(guó)外分布于印度、日本、馬來(lái)西亞半島和美國(guó)等(Clarke and Sheppard, 1972; Suwarnoetal., 2010; Hondaetal., 2012),成蟲壽命1個(gè)月左右(尹小剛等, 2015)。

已有研究報(bào)道了玉帶鳳蝶的生物學(xué)和形態(tài)學(xué)(Islam, 2019)、雌雄成蟲觸角感器類型和分布(汪洋等, 2019)、配偶選擇(Westermanetal., 2019)、不同寄主植物對(duì)玉帶鳳蝶取食、生長(zhǎng)和繁殖的影響(Shobanaetal., 2010)、玉帶鳳蝶成蟲揮發(fā)物(mura and Honda, 2005)以及雄性玉帶鳳蝶利用表皮碳?xì)浠衔飦?lái)識(shí)別異性(muraetal., 2020)等,而寄主植物揮發(fā)物對(duì)該蟲行為的影響報(bào)道甚少。廖宇(2009)發(fā)現(xiàn),玉帶鳳蝶羽化當(dāng)天即可交尾,交尾翌日開始產(chǎn)卵; Suwarno(2010)研究了玉帶鳳蝶對(duì)4種寄主植物的產(chǎn)卵選擇,發(fā)現(xiàn)在柑橘Citrusreticulata上產(chǎn)卵最多,且其更喜歡在葉片上產(chǎn)卵而不是莖上;李明濤等(2020)研究玉帶鳳蝶視覺及嗅覺識(shí)別行為表明,訪花及求偶過(guò)程中的顏色與氣味對(duì)其都有一定的誘集作用。

本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集柑橘枝葉揮發(fā)物,使用氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)及氣相色譜-觸角電位聯(lián)用系統(tǒng)(coupled gas chromatography-electroantennogram detection, GC-EAD)鑒定柑橘枝葉揮發(fā)物中對(duì)玉帶鳳蝶成蟲觸角有電生理活性的化學(xué)成分,并進(jìn)一步分析了這些化合物對(duì)該蟲嗅覺行為和產(chǎn)卵選擇行為的影響,以期為揭示玉帶鳳蝶產(chǎn)卵選擇的行為機(jī)制,以及該蟲的防治和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試?yán)ハx: 玉帶鳳蝶成蟲:2019年5-10月在四川宜賓以紅心蜜柚Citrusmaxima(Burm) Merr. cv Hongxinmiyou葉飼喂幼蟲至化蛹,將蛹帶回湖南師范大學(xué)昆蟲行為與化學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。待成蟲羽化后按性別、日齡(羽化后1個(gè)光周期視為1日齡, 其余日齡依次類推)分別置于養(yǎng)蟲籠(30 cm×30 cm×30 cm)內(nèi), 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度(27±2) ℃,相對(duì)濕度(75±5)%,提供10%蜂蜜水飼喂。選取展翅正常、健康的雌、雄成蟲供試。

1.1.2供試植物:贛南早臍橙Citrussinensiscv. Navel樹苗購(gòu)于宿遷韻嵐花卉有限公司,將樹苗栽種于花盆(高35 cm,口徑32.5 cm)中,定期施肥管理,取枝葉生長(zhǎng)發(fā)育正常的植株供試。

1.2 柑橘葉片揮發(fā)物的收集與分離鑒定

參考張萌萌等(2020)的動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集柑橘枝葉的揮發(fā)物。將一個(gè)透明、無(wú)味烤肉袋(Toppits,Minden,德國(guó))套在上述供試的贛南早臍橙樹苗上。揮發(fā)物提取裝置的連接由左向右依次為大氣采樣儀(北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所)、活性炭瓶(內(nèi)有活性炭)、氣味源、吸附管(內(nèi)有吸附劑 Porapak Q 50 mg)、流量計(jì)(上海函格生物科學(xué)有限公司)、大氣采樣儀,并均由PVC管連接,大氣采樣儀流速設(shè)定為500 mL/min(圖1)。為保證氣密性,各接口處均用封口膜密封。采集前對(duì)提取系統(tǒng)進(jìn)行1 h預(yù)處理(9:00-10:00,不接吸附劑,只是讓氣體充滿整個(gè)裝置)。揮發(fā)物采集時(shí)間為6 h(10:00-16:00)。采集完畢立即用色譜純正己烷(TEDIA,美國(guó))洗脫吸附管內(nèi)的揮發(fā)物,獲得0.5 mL洗脫液后立即置于-20 ℃冰箱中保存。依照上述實(shí)驗(yàn)步驟,取3棵生長(zhǎng)狀況同步的柑橘植株作為重復(fù),同步收集和洗脫空袋的揮發(fā)物作為對(duì)照。

圖1 柑橘枝葉揮發(fā)物的提取裝置Fig. 1 Extraction device for volatiles from the branches and leaves of citrus研究所用柑橘品種為贛南早臍橙Citrus sinensis cv. Navel。The citrus variety used in this study was Citrus sinensis cv. Navel. 下同。The same below. 圖中箭頭為氣流方向。The arrow in the figure represents the direction of air flow.

GS-MS(7890A-5975C,Agilent Technology,美國(guó))分析收集的柑橘枝葉揮發(fā)物洗脫液成分條件:樣品進(jìn)樣量為1 μL,色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,無(wú)分流進(jìn)樣,檢測(cè)器為氫氣火焰檢測(cè)器,載氣為99.999%高純度氦氣, 柱氣流量為1.0 mL/min, 柱溫升溫程序?yàn)?起始溫度50 ℃, 保持3 min, 以10 ℃/min升至250 ℃,保持1 min。再以30 ℃/min升至300 ℃,保持5 min。質(zhì)譜電離方式為EI,電離能量為70 eV,掃描質(zhì)量范圍是50～650 amu。通過(guò)核對(duì)譜庫(kù)(NIST17)的質(zhì)譜圖對(duì)揮發(fā)物的各組分進(jìn)行化學(xué)成分鑒定。

1.3 GC-EAD鑒定柑橘揮發(fā)物中對(duì)玉帶鳳蝶具有電生理活性的物質(zhì)

將玉帶鳳蝶觸角用干凈的眼科剪從基部取下,端部剪去約1 mm,再將觸角兩端分別搭在蘸有導(dǎo)電膠的銀電極兩探頭上。取柑橘苗揮發(fā)物洗脫液樣品注入氣相色譜儀的進(jìn)樣口,出口端的氣體經(jīng)過(guò)分流器以1∶1的比例,一半進(jìn)入檢測(cè)裝置,另一半混合潔凈空氣流向昆蟲觸角。觸角感受到氣相色譜分離的物質(zhì)氣流,產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)過(guò)刺激放大器后通過(guò)直流交流放大器,最后通過(guò)計(jì)算機(jī)的GC-EAD(7890B-Syntech)軟件記錄。GC分析條件設(shè)置與1.2節(jié)的GC-MS同。

每次取2 μL洗脫液樣品進(jìn)行GC-EAD測(cè)試。本研究共測(cè)試1-5日齡玉帶鳳蝶雌成蟲9頭、雄成蟲5頭。其中能引起3頭以上玉帶鳳蝶產(chǎn)生明顯EAG反應(yīng)的化合物,視為活性化合物。進(jìn)一步通過(guò)GC-MS分析鑒定這些活性化合物的種類。

1.4 供試化合物的選擇

選取1.2和1.3節(jié)引起玉帶鳳蝶成蟲EAG反應(yīng)最強(qiáng)烈且反應(yīng)頻次最高的柑橘枝葉揮發(fā)物中的3種活性化合物[葉醇、芳樟醇、(+) -檸檬烯],同時(shí)參考Liu和Zhou(2016)及劉路(2014)對(duì)蕓香科柑橘屬Citrus植物揮發(fā)性成分的分析,選取其中9種化合物[檸檬醛、愈創(chuàng)木酚、糠醇、壬醛、(-) -檸檬烯、丁酸丁酯、1-壬醇、L-香芹酮和R-香芹酮],共12種化合物供試,進(jìn)行玉帶鳳蝶成蟲的EAG和行為學(xué)測(cè)試。這些化合物在先前的研究中被發(fā)現(xiàn)對(duì)柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax有引誘或驅(qū)避作用(劉路等, 2014; Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020),或?qū)Ω涕倌臼璂iaphorinacitri有顯著引誘作用(林妗蓓等, 2020)。上述12種揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品信息見表1。

表1 供試揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品及其溶劑Table 1 Tested standard compounds of volatile compounds and their solvents

1.5 玉帶鳳蝶對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)測(cè)試

將柑橘枝葉揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷配制成0.001, 0.01, 0.1, 1, 10和100 μg/μL 6個(gè)濃度梯度,設(shè)正己烷為對(duì)照。測(cè)試前,先將玉帶鳳蝶成蟲放置于通風(fēng)無(wú)刺激氣味處?kù)o置1 h,觸角剪取和連接方法同1.3節(jié)的GC-EAD操作。將濾紙條(4 cm×0.5 cm)置入巴斯德管內(nèi),管末端連接氣體刺激控制裝置,刺激氣體流量為200 mL/min,刺激時(shí)間為500 ms。取10 μL待測(cè)樣品滴在巴斯德管內(nèi)的濾紙上,對(duì)照為等體積的正己烷。連續(xù)空氣流量為600 mL/min,經(jīng)活性炭過(guò)濾,并通過(guò)蒸餾水,提供給測(cè)試觸角。所有樣品均測(cè)試1日齡和5日齡雌、雄成蟲各5頭。測(cè)試時(shí),先用正己烷刺激觸角1次,然后依次測(cè)試各樣品,每?jī)纱未碳らg隔1 min,最后再用正己烷刺激1次。用Syntech EAD Pro軟件記錄反應(yīng)值,每條觸角重復(fù)2次,取平均值作為測(cè)試值。EAG反應(yīng)相對(duì)值(mV)=所測(cè)氣味刺激的EAG反應(yīng)值(mV)-測(cè)試前后對(duì)照刺激的EAG反應(yīng)平均值(mV)。

1.6 T型管嗅覺行為測(cè)試

自制的T型嗅覺儀參照周瓊等(2011)的Y型嗅覺儀改進(jìn),以適用于玉帶鳳蝶的行為學(xué)測(cè)試。T型管的內(nèi)徑為10 cm,導(dǎo)入管長(zhǎng)10 cm,兩臂分別長(zhǎng)40 cm,空氣在經(jīng)過(guò)大氣采樣儀(QC-1S型,北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所)后,依次通過(guò)活性炭、蒸餾水和流量計(jì),調(diào)節(jié)空氣流量為600 mL/min。

將分別滴有10 μL濃度為10 μg/μL的供試化合物和等量正己烷(對(duì)照)的濾紙片置于T型嗅覺儀兩臂端的玻璃管中。測(cè)試選擇在晴天自然光照條件下,在室內(nèi)于9:00-17:00進(jìn)行,調(diào)整T型管的位置,以保證自然光對(duì)兩臂照射的光線一致。室內(nèi)溫度(27±2) ℃。將玉帶鳳蝶從T型嗅覺儀的導(dǎo)入管引入,每次放入1頭成蟲,觀察并記錄其選擇行為。當(dāng)玉帶鳳蝶成蟲經(jīng)過(guò)T型管的交叉區(qū)域,在某一臂內(nèi)停留30 s以上則視為選擇;若成蟲在導(dǎo)入管內(nèi)5 min沒有做出選擇,則視為無(wú)反應(yīng)。每測(cè)試1頭蟲后,用吹風(fēng)機(jī)對(duì)T型管進(jìn)行空吹5 min以除去可能殘留的揮發(fā)物。每測(cè)試5頭蟲更換新的帶試劑濾紙條,同時(shí)將處理和對(duì)照雙臂互換位置,以減少氣味源和方位對(duì)玉帶鳳蝶選擇可能產(chǎn)生的影響。每個(gè)性別的蟲測(cè)試完1種物質(zhì)后,徹底清洗嗅覺儀,晾干后使用。各樣品均測(cè)試5-6日齡成蟲30頭,雌雄比為1∶1。嗅覺行為選擇率(%)= [(選擇實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M蟲數(shù))/(選擇實(shí)驗(yàn)組蟲數(shù)+選擇對(duì)照組蟲數(shù))]×100。

1.7 玉帶鳳蝶成蟲產(chǎn)卵選擇行為測(cè)試

模擬柑橘葉片形狀,將綠色卡紙剪成面積約20 cm2(長(zhǎng)7 cm、寬4 cm)的橢圓形。將經(jīng)EAG和嗅覺行為實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的4種待測(cè)物質(zhì)(包括芳樟醇、葉醇、壬醛和檸檬醛)用石蠟油配制成濃度為10 μg/μL的待測(cè)物質(zhì),取4種待測(cè)物質(zhì)各30 μL,均勻滴加在綠色卡紙上,以滴加石蠟油的綠色卡紙為對(duì)照。將上述4種處理及對(duì)照的卡紙用細(xì)鐵絲將其水平固定、間隔均勻地?cái)[放在測(cè)試籠(50 cm×50 cm×50 cm)內(nèi),卡紙離籠底約10 cm高。將盛裝紅色布料蘸浸10%蜂蜜水的培養(yǎng)皿放置在籠中提供食物營(yíng)養(yǎng)。選擇在晴天進(jìn)行測(cè)試,室內(nèi)溫度(29±1) ℃,相對(duì)濕度為60%±5%,自然光,同時(shí)用50 W的LED燈做補(bǔ)償光源以保證測(cè)試蟲籠的光照均勻。每籠引入5對(duì)5-15日齡(預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5日齡后產(chǎn)卵較多)雌、雄成蟲,設(shè)置4個(gè)重復(fù)。測(cè)試時(shí)間為9:00-17:00,每天統(tǒng)計(jì)各卡紙上的落卵量,同時(shí)更換各處理和對(duì)照卡紙。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,玉帶鳳蝶成蟲對(duì)各測(cè)試物質(zhì)的EAG反應(yīng)值在同性別不同日齡和同日齡不同性別之間用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。EAG反應(yīng)結(jié)果用Origin軟件處理數(shù)據(jù),并繪制成平滑曲線。T型管選擇行為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用卡方(χ2)檢驗(yàn),不同測(cè)試物質(zhì)對(duì)玉帶鳳蝶產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析(one-way ANOVA)最小顯著差異法(least significant difference, LSD)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 柑橘枝葉揮發(fā)物中對(duì)玉帶鳳蝶成蟲觸角具有電生理活性的化合物篩選

采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法對(duì)贛南早臍橙枝葉揮發(fā)物進(jìn)行采集和GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)其成分共有30種,分別為烯烴類(13種)、烷烴類(8種)、醇類(4種)、酯類(3種)、醛類(1種)和吡嗪類(1種)。GC-EAD測(cè)試結(jié)果顯示,贛南早臍橙枝葉揮發(fā)物中有12種成分可多次引起玉帶鳳蝶的EAG反應(yīng)(圖2),包括葉醇、α-蒎烯、檜烯、月桂烯、順-3-己烯基乙酸酯、(+)-檸檬烯、3-蒈烯、芳樟醇、α-松油醇、β-石竹烯、γ-葎草烯和正十六烷,其中能引起玉帶鳳蝶雌成蟲觸角反應(yīng)最強(qiáng)烈且反應(yīng)頻次最高有3種化合物,包括芳樟醇、(+)-檸檬烯和葉醇,9頭雌成蟲的EAG反應(yīng)頻次為88.89%～100%;同時(shí),5頭雄成蟲對(duì)芳樟醇的EAG反應(yīng)頻次也高達(dá)100%(表2)。

圖2 GC-EAD鑒定柑橘枝葉揮發(fā)物中對(duì)玉帶鳳蝶雌雄成蟲觸角具有電生理活性的化合物Fig. 2 Electrophysiologically active compounds in volatiles from the branches and leaves of citrus tothe antennae of female and male adults of Papilio polytes identified by GC-EAD1: 葉醇Leaf alcohol; 2: α-蒎烯α-Pinene; 3: 檜烯Sabinene; 4: 月桂烯Myrcene; 5: 順-3-己烯基乙酸酯cis-3-Hexenyl acetate; 6: (+)-檸檬烯(+)-Limonene; 7: 3-蒈烯3-Carene; 8: 芳樟醇Linalool; 9: α-松油醇α-Terpineol; 10: β-石竹烯β-Caryophyllene; 11: γ-葎草烯γ-Humulene; 12: 正十六烷Hexadecane; EAD: 觸角電位反應(yīng)信號(hào)Electroantennagram trace; FID: 氣相色譜信號(hào)Gas chromatography trace; GC-EAD: 氣相色譜-觸角電位聯(lián)用系統(tǒng)Coupled gas chromatography-electroantennogram detection.

2.2 玉帶鳳蝶對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)

玉帶鳳蝶對(duì)不同劑量柑橘枝葉揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品的EAG反應(yīng)結(jié)果見圖3。從圖3可以看出,測(cè)試劑量在0.01～1 000 μg的范圍內(nèi),1日齡雌成蟲觸角對(duì)所測(cè)試的12種揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品大多表現(xiàn)出劑量依賴的EAG反應(yīng),尤其是對(duì)葉醇、壬醛、芳樟醇、檸檬醛和愈創(chuàng)木酚反應(yīng)強(qiáng)烈:在測(cè)試劑量為100 μg時(shí),1日齡雌成蟲對(duì)上述5種揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)值排序?yàn)?芳樟醇(0.45 mV)>檸檬醛(0.35 mV)>壬醛(0.31 mV)>愈創(chuàng)木酚(0.30 mV)>葉醇(0.29 mV)(圖3: A-E);在測(cè)試劑量1 000 μg時(shí),1日齡雌成蟲對(duì)葉醇、壬醛和愈創(chuàng)木酚的EAG反應(yīng)值最大,分別高達(dá)0.73, 0.54和0.38 mV,且還處于上升期;而對(duì)芳樟醇、檸檬醛、1-壬醇和丁酸丁酯的EAG反應(yīng)值則分別為0.47, 0.38, 0.21和0.20 mV,已近于拐點(diǎn)或開始下調(diào)(圖3: B, C, F, G);雌成蟲對(duì)各濃度的(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯和糠醇的EAG反應(yīng)較弱,最大反應(yīng)值均低于0.10 mV(圖3: H-J)。另外,1日齡雌成蟲對(duì)所測(cè)試揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)值均高于5日齡雌成蟲,但差異不顯著(P>0.05)(圖3: A-L)。

圖3 玉帶鳳蝶成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的觸角電位反應(yīng)(EAG)Fig. 3 Electroantennogram (EAG) responses of Papilio polytes adults to the volatile compoundsfrom the branches and leaves of citrusA: 葉醇Leaf alcohol; B: 芳樟醇Linalool; C: 檸檬醛Citral; D:壬醛Nonanal; E: 愈創(chuàng)木酚Guaiacol; F: 丁酸丁酯n-Butyl butyrate; G: 1-壬醇1-Nonanol; H:(+) -檸檬烯 (+)-Limonene; I: (-) -檸檬烯(-)-Limonene; J: 糠醇 Furfuryl alcohol; K: L-香芹酮L-Carvone; L: R-香芹酮 R-Carvone. 供試化合物信息同表1。下同。For the information of the tested compounds, see Table 1. The same below.

雄成蟲對(duì)所測(cè)試化合物的EAG反應(yīng)明顯弱于雌成蟲,最高反應(yīng)值均低于0.20 mV。其中,1日齡雄成蟲對(duì)芳樟醇、檸檬醛、葉醇和壬醛的EAG反應(yīng)值,在測(cè)試劑量為1 000 μg時(shí)最大,僅為0.20～0.10 mV左右,而5日齡雄成蟲對(duì)芳樟醇、檸檬醛、葉醇和壬醛的EAG反應(yīng)值均低于0.10 mV(圖3: A-D); 1日齡雄成蟲對(duì)L-香芹酮和R-香芹酮的EAG反應(yīng)值在1 μg達(dá)到最大,5日齡雄成蟲對(duì)愈創(chuàng)木酚、糠醇、(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯的EAG反應(yīng)值在10 μg時(shí)達(dá)到最大,也均低于0.10 mV(圖3: E, H-L);雄成蟲對(duì)1-壬醇的EAG反應(yīng)弱或無(wú)反應(yīng)(圖3: G)。同時(shí),1日齡雄成蟲對(duì)各氣味化合物質(zhì)的EAG反應(yīng)值均高于5日齡雄成蟲的,但差異不顯著(P>0.05)(圖3: A-L)。

綜上,玉帶鳳蝶雌、雄成蟲均對(duì)所測(cè)試的化合物產(chǎn)生不同程度的EAG反應(yīng)。其中,雌成蟲對(duì)測(cè)試化合物的EAG反應(yīng)值顯著高于相應(yīng)日齡的雄成蟲的(P<0.05);同時(shí),1日齡雌、雄成蟲反應(yīng)值分別高于5日齡的雌、雄成蟲(P>0.05)。不同日齡和性別的玉帶鳳蝶對(duì)測(cè)試化合物的EAG反應(yīng)值的順序?yàn)?1日齡雌成蟲>5日齡雌成蟲>1日齡雄成蟲>5日齡雄成蟲。

2.3 玉帶鳳蝶成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的嗅覺行為

采用T型嗅覺儀,選取在上述EAG實(shí)驗(yàn)中引起玉帶鳳蝶成蟲產(chǎn)生較高EAG反應(yīng)的柑橘枝葉5種揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品(葉醇、芳樟醇、檸檬醛、壬醛和愈創(chuàng)木酚),以及反應(yīng)值低的檸檬烯的兩種同分異構(gòu)體(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯,測(cè)試對(duì)5-6日齡玉帶鳳蝶嗅覺行為選擇的影響,結(jié)果見圖4。從圖4可以看出,測(cè)試劑量為100 μg時(shí),雌成蟲對(duì)芳樟醇選擇率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而對(duì)壬醛、檸檬醛、葉醇、(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯的選擇率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05),對(duì)愈創(chuàng)木酚的選擇率顯著低于對(duì)照組(P<0.05);雄成蟲對(duì)芳樟醇、愈創(chuàng)木酚和檸檬醛的選擇率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而壬醛、葉醇、(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯對(duì)雄成蟲的引誘或驅(qū)避作用均不顯著(P>0.05)。

圖4 玉帶鳳蝶成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的嗅覺行為反應(yīng)Fig. 4 Olfactory behavior responses of Papilio polytes adults to the volatile compounds from the branches and leaves of citrus測(cè)試劑量為100 μg;星號(hào)和NS分別表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異顯著(P<0.05)和不顯著(P>0.05)(卡方檢驗(yàn))。The test dose was 100 μg. The asterisk and NS indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, between the experimental group and the control group (χ2 test).

2.4 柑橘枝葉揮發(fā)性化合物對(duì)玉帶鳳蝶產(chǎn)卵選擇的影響

選取在T型嗅覺行為測(cè)試中對(duì)玉帶鳳蝶雌成蟲有明顯和一定程度引誘作用的柑橘枝葉4種揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品(芳樟醇、葉醇、壬醛和檸檬醛),研究它們對(duì)玉帶鳳蝶產(chǎn)卵選擇行為的影響,結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出,玉帶鳳蝶表現(xiàn)出對(duì)柑橘枝葉不同揮發(fā)性化合物具有明顯產(chǎn)卵選擇偏好,測(cè)試劑量為300 μg時(shí),在滴有葉醇和芳樟醇的測(cè)試卡紙上的平均落卵量顯著高于滴有壬醛、檸檬醛及石蠟油(對(duì)照組)的測(cè)試卡紙上的(P<0.05);同時(shí),滴有壬醛和檸檬醛測(cè)試卡紙上的平均落卵量也多于對(duì)照組的,但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 柑橘枝葉揮發(fā)性化合物對(duì)玉帶鳳蝶雌成蟲產(chǎn)卵選擇的影響Fig. 5 Effects of volatile compounds from the branches and leaves of citrus on the oviposition preference of female adults of Papilio polytes測(cè)試劑量為300 μg; 以石蠟油作為對(duì)照; 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05, LSD檢驗(yàn))。The test dose was 300 μg. Paraffin oil was used as the control. Data in the figure are mean ±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference (P <0.05, LSD test).

3 討論

蕓香科柑橘屬不同植物的揮發(fā)物隨物種在化合物的組成和含量上有一定的差異,但有些特征性成分是共同的,從而形成對(duì)寡食性昆蟲的引誘作用。Liu和Zhou (2016)、劉路等(2014)采用水蒸氣蒸餾法從冰糖橙Citrussinensiscv. Bingtang、蜜桔Citrusreticulatacv. Satsuma、酸橙Citrusaurantium、南桔Citrusreticulata等鮮果皮中分離鑒定出芳樟醇、檸檬烯等多種共同成分;湯夏安等(2021)采用固相微萃取技術(shù)分析蕓香科植物嫩梢的12種揮發(fā)性化合物,鑒定出含芳樟醇、D-檸檬烯等8種共同成分;李可(2020)對(duì)臍橙C.sinensis、紅江橙Citrussinensis‘Hongjiangcheng’、溫州蜜柑Citrusunshiu、尤力克檸檬Citruslimon‘Eureka’、香水檸檬Citruslimon‘Xiangshui lemon’的青果揮發(fā)物進(jìn)行鑒定分析,也發(fā)現(xiàn)均含有芳樟醇、檸檬烯等。另外,同種植物的揮發(fā)物成分隨地理環(huán)境、季節(jié)、生長(zhǎng)時(shí)期和器官部位的不同,也存在組成和含量上的差異。Bai等(2016)研究表明季節(jié)變化和日變化都會(huì)影響亞熱帶竹林揮發(fā)性物質(zhì)的釋放;吳蘭花(2019)鑒定分析發(fā)現(xiàn)南豐蜜桔Citrusreticulata春、夏、秋、冬四季嫩梢揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量存在很大差異。棗樹Zizyphusjujuba在幼葉期、花期和幼果期的揮發(fā)物成分有明顯不同,其中幼果期的揮發(fā)物種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于幼葉期,且每個(gè)發(fā)育期均有其特有揮發(fā)物(韓穎等, 2010)。本研究用于測(cè)試玉帶鳳蝶的12種揮發(fā)性化合物中,僅芳樟醇、檸檬烯、葉醇在贛南早臍橙枝葉的揮發(fā)物中檢測(cè)到,其余9種化合物雖在本研究的柑橘苗中未檢測(cè)到,但在柑橘屬其他的寄主植物揮發(fā)物中有報(bào)道(萬(wàn)珊等, 2010; 劉路等, 2014; Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020),說(shuō)明柑橘屬寄主植物揮發(fā)物的種類和含量隨物種、地理環(huán)境、生長(zhǎng)時(shí)期、環(huán)境因子(溫度、陽(yáng)光等)、受害狀態(tài)等發(fā)生變化,但某些特征性成分是共同的,如均含有芳樟醇。玉帶鳳蝶主要以蕓香科柑橘屬的植物為食,根據(jù)以往報(bào)道的蕓香科植物的揮發(fā)性成分以及本研究的結(jié)果,提示芳樟醇在玉帶鳳蝶的寄主定位和產(chǎn)卵選擇中起重要作用。

EAG技術(shù)是一種在昆蟲學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的電生理方法,它可以直接檢測(cè)昆蟲對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)信號(hào)反應(yīng)(田厚軍等, 2011),利用EAG反應(yīng)分析引起昆蟲電生理反應(yīng)的植物揮發(fā)性化合物,可以為初步篩選引誘或驅(qū)避物質(zhì)提供基礎(chǔ)(Bhowmiketal., 2016; 錢明惠等, 2018)。玉帶鳳蝶對(duì)柑橘枝葉12種揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在測(cè)試劑量為0.01～1 000 μg時(shí),葉醇、芳樟醇、檸檬醛、壬醛和愈創(chuàng)木酚均能引起玉帶鳳蝶雌、雄成蟲產(chǎn)生不同程度劑量依賴的EAG反應(yīng)(圖3)。在測(cè)試劑量最大(1 000 μg)時(shí),該蟲對(duì)一部分揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)值已達(dá)到拐點(diǎn),如芳樟醇、檸檬醛等;對(duì)另一部分揮發(fā)性化合物的反應(yīng)仍處于上升階段,如葉醇、壬醛、愈創(chuàng)木酚等;還對(duì)一部分物質(zhì)的反應(yīng)已下降,如香芹酮(圖3)。說(shuō)明玉帶鳳蝶對(duì)寄主揮發(fā)物不同成分的嗅覺敏感性有差異,其他植食性昆蟲也有類似的結(jié)果。如華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita對(duì)桃樹Amygdaluspersica揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對(duì)值在不同的劑量有顯著差異,當(dāng)劑量為0.01和0.1 μg時(shí),雄成蟲對(duì)水楊酸甲酯的EAG反應(yīng)值顯著大于對(duì)Z-β-羅勒烯,而在劑量為1和10 μg時(shí),該蟲對(duì)各寄主植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)值均無(wú)顯著差異(張諾等, 2021)。同樣蘋褐帶卷蛾P(guān)andemisheparana成蟲對(duì)不同類型寄主植物揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)活性存在差異,如雄成蟲對(duì)醛類、腈類揮發(fā)物的平均EAG反應(yīng)相對(duì)值整體較高(分別為0.726和0.715 mV),而對(duì)萜烯類揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)相對(duì)值較低(0.178 mV)(李廣偉等, 2022)。

不同性別昆蟲對(duì)寄主植物氣味的嗅覺敏感性也存在差異。本研究的嗅覺行為選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在測(cè)試劑量為100 μg時(shí),僅有芳樟醇對(duì)玉帶鳳蝶雌、雄成蟲有顯著的引誘作用(圖4),與在該劑量玉帶鳳蝶對(duì)芳樟醇的EAG反應(yīng)最高這一結(jié)果(圖3)一致;而該劑量的葉醇和壬醛雖能引起雌成蟲較強(qiáng)的EAG反應(yīng),雌成蟲并未表現(xiàn)出明顯的EAG反應(yīng)(圖3);同時(shí),該劑量的檸檬醛僅顯著吸引雄成蟲,愈創(chuàng)木酚顯著驅(qū)避雌成蟲而顯著吸引雄成蟲(圖4)。相同日齡的玉帶鳳蝶雌成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)值明顯高于雄成蟲,說(shuō)明其雌成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)物感知的敏感性高于雄成蟲,但能引起行為反應(yīng)的閾值比雄成蟲高,提示玉帶鳳蝶雌、雄成蟲對(duì)不同化合物的行為反應(yīng)閾值有差異(圖4),該結(jié)果與王延來(lái)等(2020)報(bào)道的昆蟲對(duì)植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)與行為反應(yīng)率并非總是呈正相關(guān)類似;灰茶尺蠖Ectropisgrisescens雌、雄蟲對(duì)非寄主植物土荊芥Chenopodiumambrosioides、留蘭香Menthaspicata和黃花蒿Artemisiaannua的精油表現(xiàn)出隨濃度而變化的EAG反應(yīng),但僅留蘭香精油對(duì)灰茶尺蠖有顯著的驅(qū)避作用,土荊芥和黃花蒿精油的定向作用不明顯(張方梅等, 2018)。樟青鳳蝶Graphiumsarpedon雌成蟲比雄成蟲對(duì)寄主植物頂空揮發(fā)物表現(xiàn)出更強(qiáng)的EAG反應(yīng)(Lietal., 2010),香蕉象甲Cosmopolitessordidus(Budenbergetal., 1993)、棗飛象Scythropusyasumatsui(閻雄飛等, 2020)、甘薯蟻象Cylasformicarius(賈小儉等, 2017)、綠豆象Callosobruchuschinensis(王宏民等, 2017)等植食性昆蟲中都得到類似的結(jié)果。上述結(jié)果提示,植食性昆蟲對(duì)寄主植物不同的揮發(fā)性化合物,其EAG反應(yīng)和行為反應(yīng)各自存在一定的閾值和最佳劑量范圍。當(dāng)然,玉帶鳳蝶成蟲的行為反應(yīng)可能還受測(cè)試時(shí)的溫濕度、光照、日齡、昆蟲的生理狀況和性成熟程度等因素影響,與其他昆蟲(Weeetal., 2010; Wangetal., 2015)類似。大多數(shù)昆蟲的雌蟲比雄蟲對(duì)寄主氣味更敏感,與其在尋找寄主和繁殖等行為中所采取的策略不同有關(guān),雌蟲需要定位合適的寄主以產(chǎn)卵繁衍后代(趙鳳霞, 1995; 張萌萌等, 2020)。

不同日齡或不同性成熟程度的成蟲對(duì)氣味的敏感性也有差異。豆野螟Marucavitrata的雌蛾求偶行為、主要性信息素組分和雄性反應(yīng)均具有日齡相關(guān)性(Wangetal., 2015)。杜迎剛等(2015)發(fā)現(xiàn),橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis雌、雄成蟲從1日齡開始就對(duì)甲基丁香酚產(chǎn)生較強(qiáng)的 EAG 反應(yīng),但4日齡成蟲的EAG反應(yīng)值較低,而4日齡成蟲是橘小實(shí)蠅性器官發(fā)育的關(guān)鍵日齡,他們認(rèn)為橘小實(shí)蠅對(duì)甲基丁香酚的感受代謝機(jī)理比較復(fù)雜。van Loon等(1992)研究了歐洲粉蝶Pierisbrassicae和菜粉蝶P.rapae對(duì)寄主植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng),發(fā)現(xiàn)這兩種蝴蝶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物的刺激反應(yīng)均隨著日齡而變化。本研究中,1日齡的玉帶鳳蝶雌、雄成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)值均比5日齡的高(圖3),說(shuō)明1日齡成蟲對(duì)柑橘枝葉揮發(fā)物更敏感,推測(cè)其生物學(xué)意義可能與玉帶鳳蝶羽化時(shí)即已性成熟開始求偶交尾有關(guān),這時(shí)玉帶鳳蝶需要通過(guò)寄主植物揮發(fā)物定位寄主和配偶,與已報(bào)道的寄主植物揮發(fā)物可以刺激蘋果蠹蛾Cydiapomonella雌蛾釋放信息素、求偶和產(chǎn)卵(Yanetal., 1999)、天牛的雌雄兩性均各自被寄主植物揮發(fā)物吸引到寄主上后,再進(jìn)行性信息素的通訊聯(lián)系(Ginzel and Hanks, 2005)類似;同時(shí),玉帶鳳蝶雌蟲對(duì)植物氣味物質(zhì)敏感,還與其定位合適的寄主植物產(chǎn)卵有關(guān)。而玉帶鳳蝶5日齡成蟲的EAG反應(yīng)值低(圖3),可能與其因?yàn)楸┞对谕饨绛h(huán)境的時(shí)間長(zhǎng),接觸包括寄主植物揮發(fā)物在內(nèi)的外界環(huán)境各種干擾氣味較多而產(chǎn)生一定程度的感覺適應(yīng)有關(guān),這與李可(2020)研究不同日齡和性別的柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax成蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物N-(3-甲基丁基)乙酰胺 [N-(3-methyl-butyl) acetamide] 的EAG 反應(yīng)時(shí),3日齡雌、雄成蟲較之于15日齡雌、雄成蟲的EAG反應(yīng)值高的情況類似。

許多鳳蝶的產(chǎn)卵刺激系統(tǒng)需要多種因素的協(xié)同作用(Honda, 1990; Ohsugietal., 1991),評(píng)估潛在的合適宿主主要是通過(guò)用前足敲打樹葉表面來(lái)實(shí)現(xiàn)的,在此過(guò)程中,植物化學(xué)物質(zhì)被跗節(jié)的化學(xué)和觸覺感受器感知(Roessinghetal., 1991),盡管寄主植物的非揮發(fā)性成分在鳳蝶的產(chǎn)卵活動(dòng)中起重要作用(Nakayamaetal., 2003),但來(lái)自寄主植物的嗅覺線索可以通過(guò)影響鳳蝶的寄主定位,從而刺激雌性產(chǎn)卵(Bauretal., 1993; Baur and Feeny, 1994; Heinz, 2008; Tangetal., 2013)。我們的研究結(jié)果支持上述觀點(diǎn),作為寄主柑橘枝葉揮發(fā)物的成分芳樟醇,對(duì)玉帶鳳蝶有明顯的引誘和產(chǎn)卵引誘作用,但僅靠這單一的揮發(fā)性化合物引誘過(guò)來(lái)的玉帶鳳蝶在模擬柑橘葉片的紙片上的日均落卵量?jī)H為3.75粒/卡紙(圖5),提示玉帶鳳蝶的產(chǎn)卵選擇及其落卵量除了受寄主植物揮發(fā)物的引誘作用的影響外,可能也與產(chǎn)卵基質(zhì)表面的物理性質(zhì)和非揮發(fā)性的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)(Roessinghetal., 1991; Nakayamaetal., 2003)、周圍環(huán)境(比如光照、溫度、濕度、風(fēng)力)、幼蟲營(yíng)養(yǎng)、成蟲的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、玉帶鳳蝶雌蟲自身的生理狀態(tài)等因素密切相關(guān)。另?yè)?jù)報(bào)道,芳樟醇還是玉帶鳳蝶兩性成蟲的揮發(fā)物成分,且在雄性體內(nèi)芳樟醇含量更高(mura and Honda, 2005),結(jié)合本研究芳樟醇可引起玉帶鳳蝶雌、雄成蟲顯著的EAG反應(yīng)以及均有明顯引誘作用的結(jié)果(圖3, 4),提示芳樟醇在玉帶鳳蝶的寄主識(shí)別定位以及兩性活動(dòng)中起重要作用,同時(shí),也是玉帶鳳蝶的產(chǎn)卵刺激劑。

已有研究表明,柑橘揮發(fā)物中的芳樟醇、檸檬醛、壬醛、檸檬烯和丁酸丁酯對(duì)柑橘大實(shí)蠅雌成蟲有明顯的引誘作用,愈創(chuàng)木酚、糠醇對(duì)柑橘大實(shí)蠅雌成蟲有顯著驅(qū)避作用(Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020)。L-香芹酮對(duì)柑橘木虱有顯著引誘作用(林妗蓓等, 2020)。本研究結(jié)果顯示,這些化合物僅芳樟醇對(duì)玉帶鳳蝶雌成蟲有明顯引誘作用,愈創(chuàng)木酚對(duì)玉帶鳳蝶雌成蟲有明顯驅(qū)避作用;其余對(duì)柑橘大實(shí)蠅或柑橘木虱有引誘作用的寄主揮發(fā)物包括檸檬烯、檸檬醛、壬醛、L-香芹酮等并未對(duì)玉帶鳳蝶成蟲行為有明顯影響(圖4),說(shuō)明以相同寄主為食的不同植食性昆蟲,引起它們行為反應(yīng)的寄主植物揮發(fā)物有差異,這可能在植食性昆蟲與植物長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化以及植食性昆蟲的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)中具有重要意義,是值得進(jìn)一步探討的問題。

致謝承蒙湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所陳昂博士為本研究提供GC-MS分析幫助,長(zhǎng)沙市望城區(qū)光明蝴蝶文化主題公園毛舟農(nóng)藝師提供蟲源支持,在此一并表示衷心感謝!