姬雪嬌, 崔 麗, 王文杰, 楊慶杰, 翟艷慧, 芮昌輝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 北京 100193)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda又稱秋粘蟲,原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū),是一種世界性的遷飛性害蟲。自2016年1月在非洲首次報道以來,目前已入侵超過130個國家 (Goergenetal., 2016; Rwomushana, 2022)。由于草地貪夜蛾適應(yīng)力強(11～30 ℃均可發(fā)育、無滯育現(xiàn)象)、食性雜(偏好禾本科,在其他科也可見,如菊科、豆科)、繁殖力強(平均1 500粒/雌,最高可達2 000粒/雌)、遷飛遠(每晚定向遷飛100 km)等特點,使其能迅速在遷入地定殖、擴散為害,因此其嚴重威脅我國玉米的生產(chǎn)安全(郭井菲等, 2019)?；瘜W(xué)防治是控制草地貪夜蛾危害的主要手段。但由于長期的藥劑選擇和其自身的強大適應(yīng)性,草地貪夜蛾已對40多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性,既包括有機磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等傳統(tǒng)殺蟲劑,也包括雙酰胺類和多殺霉素等新型殺蟲劑(王芹芹等, 2019; 吳益東等, 2019);另外室內(nèi)生物測定和靶標(biāo)突變分析均表明,入侵中國的草地貪夜蛾已對有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性,影響了其防治效果(Zhangetal., 2021; Wangetal., 2023)。

溴蟲氟苯雙酰胺(broflanilide)是由三井化學(xué)和巴斯夫共同開發(fā)的作用于γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid receptors, GABARs)的新型間二酰胺類藥劑,并進一步被IRAC歸類為30組(γ-氨基丁酸門控氯離子通道變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)。與現(xiàn)有的殺蟲劑無交互抗性。對鱗翅目、鞘翅目等昆蟲有很高的活性(Katsutaetal., 2019)。于2020年12月28日在我國正式登記。作為一種新型的殺蟲劑,溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的毒力和田間藥效均表現(xiàn)突出。10%溴蟲氟苯雙酰胺SC對草地貪夜蛾3齡和5齡幼蟲均有較強的活性,72 h的校正死亡率均高于90%,田間藥效試驗表明,不同用量的10%溴蟲氟苯雙酰胺SC處理后1和7 d防效均可達96.33%以上,顯著高于對照藥劑5.7%甲維鹽ME和200 g/L氯蟲苯甲酰胺SC(王風(fēng)良等, 2022)。王敏等(2022)研究也發(fā)現(xiàn),溴蟲氟苯雙酰胺室內(nèi)毒力顯著高于硫蟲酰胺和四唑蟲酰胺,僅次于甲維鹽;在田間用藥后7 d,100 g/L溴蟲氟苯雙酰胺SC對玉米草地貪夜蛾的防效與對照藥劑5.7%甲維鹽DF和10%硫蟲酰胺SC相當(dāng),均在93%以上,顯著高于18%四唑蟲酰胺SC的防效。溴蟲氟苯雙酰胺在草地貪夜蛾防治上表現(xiàn)出優(yōu)異的速效性和持久性,是一種良好的田間應(yīng)急防控替代藥劑。目前,害蟲對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性研究還處于起步階段,僅有1例關(guān)于小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的報道。小菜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險較低,10代內(nèi)敏感性幾乎沒有變化(Sunetal., 2022)。鑒于溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的防治優(yōu)越性和抗性情況還未見報道,本研究通過室內(nèi)連續(xù)10代選育后,測定草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性、解毒酶活性以及適合度變化,旨在明確草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的早期抗性風(fēng)險和生化機理,以期為該殺蟲劑在田間合理使用和草地貪夜蛾的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

草地貪夜蛾為室內(nèi)繁育種群(來自海南種群、華寧種群和玉溪種群的成蟲交配所得的后代),一部分后代作為未汰選種群UNSEL(不接觸藥劑進行飼養(yǎng)),一部分后代作為汰選種群Bro-SEL(連續(xù)接觸藥劑進行汰選)。初孵幼蟲通過人工飼料群體飼養(yǎng)至3齡幼蟲后,再轉(zhuǎn)移到在25 mL連體杯中進行單頭飼養(yǎng),直至化蛹,將蛹挑入9 cm培養(yǎng)皿中,待其開始羽化后轉(zhuǎn)移至成蟲籠中,進行交配。每日補充新鮮蜂蜜水并收集產(chǎn)卵紙。飼養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃,相對濕度60%～70%和光周期14L∶10D。草地貪夜蛾人工飼料配方為: 75 g豆餅粉、75 g玉米面、 30 g啤酒酵母、210 g番茄醬、14 g瓊脂和900 mL開水。

1.2 供試藥劑與試劑

98.0%溴蟲氟苯雙酰胺原藥,日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn);酶液提取試劑[乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)、二硫代蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、苯基硫脲(phenylthiourea, PTU)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)]均購自北京廣達恒益;酶活性測定試劑[牛血清蛋白,考馬斯亮藍G-250,α/β-醋酸萘酯(α/β-napthyl acetate, α/β-NA),固藍B鹽,十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS),毒扁豆堿,1-氯-2, 4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB),還原性谷胱甘肽(glutathione, GSH)]均購自北京廣達恒益;CYP450活性測定試劑盒購自上海恒遠生物;增效醚(piperonyl butoxide, PBO)(95%),磷酸三苯酯(triphenyl phosphate, TPP)(95%)和馬來酸二乙酯(diethyl maleate, DEM)(95%)購自上海阿拉丁試劑。

1.3 抗性選育

溴蟲氟苯雙酰胺汰選種群Bro-SEL建立:取1 mL濃度為0.25 mg/L溴蟲氟苯雙酰胺藥液均勻涂抹在31.8 cm2人工飼料上(9 cm的培養(yǎng)皿),待藥液自然風(fēng)干后,將200～300頭左右的初孵幼蟲挑入其中。飼養(yǎng)4 d時統(tǒng)計死亡率,并將存活的幼蟲轉(zhuǎn)移至無毒飼料中飼養(yǎng)。每代汰選600～1 200頭左右(3～4個重復(fù))。選擇壓力在70%～80%死亡率之間。以0.25 mg/L的濃度連續(xù)汰選10代。取汰選后1代種群[Bro-SELC(G1)]和10代種群Bro-SEL 3齡幼蟲用于毒力和解毒酶活性測定。

1.4 毒力測定方法

參考飼料表面涂毒法進行生物測定(Okumaetal., 2018)。配好的人工飼料和水按照1∶1(m/m)加熱混勻,分裝到孔直徑16 mm、深17 mm的24孔盒內(nèi),每孔大約0.6 mL,冷卻后加蓋備用。使用0.05% (w/v) Triton X-100的水溶液將1%的母液(丙酮溶解)稀釋5～7個濃度梯度。0.05% Triton X-100的水溶液作為空白對照。將配制好的溶液以每孔30 μL的體積添加到24孔盒飼料表面。室溫下干燥后,用鑷子往每孔加入1頭3齡幼蟲并用蓋子封住。每個濃度處理24頭幼蟲。藥劑處理后恢復(fù)條件同飼養(yǎng)條件。48 h時統(tǒng)計死亡率,計算致死中濃度(median lethal concentration, LC50)。以毛筆尖觸碰幼蟲后不能正常轉(zhuǎn)曲為判斷死亡的標(biāo)準。

表1 溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力Table 1 Toxicity of broflanilide to the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda

1.5 種群生命表建立

分別收集UNSEL和Bro-SEL種群成蟲第2-3 天產(chǎn)的卵塊,每個種群各收集10塊。待孵化后,每塊孵化的卵塊中挑選10頭幼蟲。每頭幼蟲放于一個裝有1 g左右飼料體積為25 mL塑料連體杯中,每個種群100頭幼蟲。每24 h觀察并記錄幼蟲的發(fā)育和死亡情況,直至化蛹。飼料根據(jù)取食量和新鮮程度適時更換?；嫉?天,用萬分之一天平稱重后再辨別雌雄,之后轉(zhuǎn)移至一個3 cm培養(yǎng)皿中。待成蟲出現(xiàn)后,將同一天羽化的雌雄成蟲配對放入一個500 mL塑料量杯中(內(nèi)有產(chǎn)卵紙和10%蜂蜜水), 并用棉紗布封口。每天更換產(chǎn)卵紙和棉紗布并適時補充蜂蜜水,記錄每天的產(chǎn)卵量,直至成蟲死亡。實驗條件同前面的飼養(yǎng)條件。

1.6 解毒酶活性測定

1.6.1酶液制備:收集UNSEL和Bro-SEL種群的3齡中期幼蟲,每5頭加入1 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽液PBS[pH 7.8,包含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF 和10%(w/w)甘油],冰上研磨勻漿,4 ℃下12 000 r/ min離心15 min,取上清液作為酶源,進行細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP450)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)活性測定。將該酶源用pH 7.0,0.04 mol/L PBS緩沖液稀釋20倍用于測定羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)活性。共3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6.2CYP450活性測定:采用雙抗體夾心法測定CYP450活性。按照制造商說明書的要求,在有純化的昆蟲CYP450抗體包被的微孔板中加入樣品、酶標(biāo)試劑,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過溫育和徹底洗滌后加底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)避光顯色,之后加終止液混勻,顏色由藍變黃。用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光度。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.6.3CarE活性測定:參照van Asperen (1962)測定CarE活性,略有改動。酶反應(yīng)體系包括600 μL反應(yīng)混合液(含0.3 mmol/L α-NA, 1×10-4mol/L 毒扁豆堿和pH 7.0的0.1 mol/L PBS緩沖液)和120 μL的稀釋酶液。然后在30 ℃金屬浴中振動30 min。之后添加120 μL的顯色劑(質(zhì)量分數(shù)1%固藍B鹽∶5% SDS=5∶2, v/v, 現(xiàn)配現(xiàn)用),混勻后室溫靜置30 min,用酶標(biāo)儀測定600 nm 下的吸光度?？瞻讓φ找詐H 7.0,0.1 mol/L PBS緩沖液代替酶液。每個樣品重復(fù)測定3次。將底物α-NA換為β-NA,酶活性測定方法不變。

1.6.4GST活性測定:參照Habig等(1974)方法以CDNB為底物測定GST活性。酶反應(yīng)體系共1.5 mL,包含1.2 mL 66 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.0,含2 mmol/L EDTA), 0.15 mL 50 mmol/L GSH, 0.05 mL 30 mmol/L CDNB和0.1 mL的酶液,空白對照以pH 7.0, 66 mmol/L PBS緩沖液代替酶液。立即在27 ℃, 340 nm下連續(xù)測定5 min內(nèi)吸光度變化。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.6.5總蛋白含量測定:參照Bradford (1976)的考馬斯亮藍G-250法測定總蛋白含量。

1.7 增效劑對溴蟲氟雙酰胺增效作用的測定

用0.05% Triton X-100的水溶液將PBO, TPP和DEM分別配制成100 mg/L的溶液,然后用此溶液將1%溴蟲氟苯雙酰胺母液稀釋成5～7個濃度梯度。以100 mg/L增效劑水溶液作為空白對照。其他條件同毒力測定。計算增效比(synergistic ratio)(單獨使用溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50值/溴蟲氟苯雙酰胺加增效劑對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50值)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

毒力回歸方程和LC50采用統(tǒng)計軟件DPS(7.05)生物測定模板進行計算;解毒酶活性利用統(tǒng)計DPS的LSD法進行顯著性差異分析;利用 TWOSEX-MSChart 軟件,基于年齡階段、兩性生命表理論對原始生命表數(shù)據(jù)進行分析(Chi and Liu, 1985; Chi, 1988),計算出每個種群不同發(fā)育階段的歷期、單雌產(chǎn)卵量、內(nèi)稟增長率r、周限增長率λ、凈增殖率R0、平均世代周期T;根據(jù)paired bootstrap test 法計算UNSEL和Bro-SEL 種群生命表參數(shù)和種群參數(shù)的平均值和標(biāo)準誤及其兩者的顯著性差異,進行100 000次評估。相對適合度R=Bro-SEL種群的R0/UNSEL種群的R0。繪圖使用Origin 軟件。生命表主要參數(shù)所用計算公式如下所述:

特定年齡存活率lx:

特定年齡繁殖力mx:

凈增殖率R0:

內(nèi)稟增長率r:

周限增長率λ:

λ=er;

平均世代周期T:

特定年齡-齡期生命期望值exj:

特定年齡-齡期繁殖力vxj:

2 結(jié)果

2.1 溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群的毒力比較

經(jīng)1和10代汰選后,溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力變化見表1。結(jié)果顯示:草地貪夜蛾初孵幼蟲以0.25 mg/L溴蟲氟苯雙酰胺汰選10代后,與未汰選種群UNSEL相比, 溴蟲氟苯雙酰胺處理48 h時對汰選10代種群Bro-SEL 3齡幼蟲的LC50值由0.17 mg/L增加到0.46 mg/L;與未汰選種群UNSEL相比, Bro-SEL的抗性倍數(shù)為2.71,但汰選1代種群Bro-SEL (G1)的抗性倍數(shù)僅為2.12。這表明,經(jīng)過持續(xù)的較高強度的選擇壓力,草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性倍數(shù)變化很少,抗性僅增加1.71倍,抗性水平仍處于敏感階段。

2.2 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群生命表參數(shù)和適合度比較

2.2.1草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群發(fā)育與繁殖比較:草地貪夜蛾經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后,Bro-SEL種群的發(fā)育歷期與繁殖力發(fā)生了顯著的變化(表2)。與未汰選種群UNSEL相比, 汰選種群Bro-SEL的2齡幼蟲歷期, 3齡幼蟲歷期, 6齡幼蟲歷期, 成蟲產(chǎn)卵前期(adult preoviposition period, APOP)和總產(chǎn)卵前期(total preovipositior period, TPOP)均極顯著延長(P<0.01),蛹歷期顯著延長(P<0.05)。同時,Bro-SEL種群的單雌產(chǎn)卵量[(681.85±97.52)粒]也顯著低于UNSEL種群的[(1 237.51±77.25)粒](P<0.01)。

表2 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群的發(fā)育歷期和繁殖力Table 2 Developmental duration and fecundity of the UNSEL and Bro-SEL populations of Spodoptera frugiperda

2.2.2草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群蛹重比較:草地貪夜蛾經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后, Bro-SEL 種群平均蛹重較UNSEL種群沒有明顯改變(圖1)。UNSEL和Bro-SEL種群的蛹的重量主要分布于200～250 mg范圍,其中在230～240 mg范圍內(nèi)占比最高,分別為22.45%和21.52%。Bro-SEL種群的平均蛹重[(226.78±2.53) mg]略高于UNSEL種群的平均蛹重[(221.92±1.73) mg],但兩者差異不顯著(P>0.05)。但是,Bro-SEL種群部分蛹重可高達260～280 mg,總占比8.86%。說明長期接觸溴蟲氟苯雙酰胺有可能會提高部分個體的蛹的重量。

圖1 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群的蛹重分布圖Fig. 1 Distribution of the pupal weight of the UNSEL andBro-SEL populations of Spodoptera frugiperda

2.2.3草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群參數(shù)比較:草地貪夜蛾經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后,Bro-SEL的種群參數(shù)較UNSEL種群也發(fā)生明顯的變化(表3)。Bro-SEL種群的平均世代周期[(35.13±0.64) d]極顯著高于UNSEL種群的[(30.61±0.28) d](P<0.01)。然而,Bro-SEL種群的內(nèi)稟增長率[(0.15±0.01) d-1]、周限增長率[(1.16±0.01) d-1]和凈增殖率(184.26±39.91)與UNSEL種群的[分別為(0.20±0.01) d-1, (1.23±0.01) d-1和(531.86±69.7)]相比均減小,且差異極顯著(P<0.01)。Bro-SEL種群的相對適合度為0.35。說明Bro-SEL種群存在適合度代價。

表3 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群的種群參數(shù)Table 3 Population parameters of the UNSEL and Bro-SEL populations of Spodoptera frugiperda

2.2.4草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群存活率與繁殖力的比較:與UNSEL相比,Bro-SEL種群的sxj曲線的重疊程度更高, 說明長期接觸溴蟲氟苯雙酰胺會影響草地貪夜蛾個體間的發(fā)育速率。同時,Bro-SEL種群從2齡幼蟲開始的各個階段的存活率均低于UNSEL種群,并且Bro-SEL種群在6齡幼蟲和蛹期的發(fā)育時間均高于UNSEL種群(圖2: A, B)。

圖2 草地貪夜蛾UNSEL (A)和Bro-SEL(B)種群的特定年齡-齡期存活率(sxj)Fig. 2 Age-stage-specific survival rates (sxj) of the UNSEL (A) and Bro-SEL (B) populations of Spodoptera frugiperdaEgg: 卵; L1-L6: 分別為1-6齡幼蟲1st-6th instar larvae, respectively; Pupa: 蛹; Female: 雌成蟲Female adult; Male: 雄成蟲Male adult. 圖4和5同。The same for Figs.4 and 5.

特定年齡存活率(lx)是指從卵存活到x年齡的可能性,忽略了齡期,描述了草地貪夜蛾隨年齡變化的存活率,也是sxj的簡化曲線。相比于UNSEL存活曲線在成蟲前期坡度較平緩,Bro-SEL存活曲線在成蟲前期坡度較陡(圖3: A),說明Bro-SEL個體在幼蟲階段存活率低。在第37天時Bro-SEL成蟲存活率開始高于UNSEL(圖3: A)。特定年齡繁殖力mx表示草地貪夜蛾在x年齡的平均產(chǎn)卵量。Bro-SEL和UNSEL種群的mx曲線整體上表現(xiàn)先增后降的趨勢,但Bro-SEL種群的mx曲線出現(xiàn)波動(圖3: B),這表明藥劑處理影響了草地貪夜蛾的產(chǎn)卵期,不僅導(dǎo)致平均產(chǎn)卵量降低,還導(dǎo)致出現(xiàn)了間斷性產(chǎn)卵。種群特定年齡凈繁殖率(lxmx)表示草地貪夜蛾存活個體在x年齡時的繁殖值,即凈產(chǎn)卵量。Bro-SEL種群的凈產(chǎn)卵量是明顯低于UNSEL種群的(圖3: C)。雌成蟲特定年齡繁殖力(fx9)表示草地貪夜蛾雌成蟲在x年齡的產(chǎn)卵量。fx9曲線和mx曲線具有相同的變化趨勢(圖3: D)。UNSEL雌成蟲第26天開始產(chǎn)卵,第28天達到產(chǎn)卵高峰,雌成蟲特定年齡繁殖力為216.53;Bro-SEL雌成蟲第29天開始產(chǎn)卵,第35天達到產(chǎn)卵高峰,雌成蟲特定年齡繁殖力為99.12(圖3: D)。

在卵期,UNSEL和Bro-SEL種群的繁殖力貢獻值均與各自的周限增長率相同,分別為1.23和1.16 d-1(表3)。雌成蟲出現(xiàn)后,UNSEL種群在第27天的特定年齡-齡期繁殖值最大,為775.2(圖4: A),而Bro-SEL種群在第31天達到最大特定年齡-齡期繁殖值,為395.4(圖4: B)。

圖4 草地貪夜蛾UNSEL (A)和Bro-SEL(B)種群的特定年齡-齡期繁殖值(vxj)Fig. 4 Age-stage-specific reproductive values (vxj) of the UNSEL (A) and Bro-SEL (B) populations of Spodoptera frugiperda

UNSEL和Bro-SEL種群的特定年齡-齡期生命期望值隨年齡的增長而逐漸降低(圖5: A, B)。在進入卵、1齡幼蟲、5齡幼蟲和蛹期,Bro-SEL種群的特定年齡-齡期生命期望值(分別為30.41, 27.41, 26.19和19.15 d)明顯低于UNSEL種群的(分別為35.44, 32.44, 26.99和19.33 d);而在進入2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、6齡幼蟲、雌成蟲和雄成蟲期,Bro-SEL種群的特定年齡-齡期生命期望值(分別為31.89, 30.19, 29.19, 24.19, 15.30和10.38 d)則明顯高于UNSEL種群的(31.70, 29.99, 28.99, 23.99, 12.34和9.15 d),尤其在雌成蟲階段,Bro-SEL種群的特定年齡-齡期生命期望值延長達2.96 d(圖5: A, B)。

圖5 草地貪夜蛾UNSEL (A)和Bro-SEL (B)種群的特定年齡-齡期生命期望值(exj)Fig. 5 Age-stage-specific life expectancy (exj) of the UNSEL(A) and Bro-SEL (B) populations of Spodoptera frugiperda

2.3 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群體內(nèi)解毒酶活性比較

經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后,草地貪夜蛾Bro-SEL種群3齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性發(fā)生了改變(圖6)。與未汰選種群UNSEL(對照)相比,Bro-SEL種群體內(nèi)CarE活性顯著升高,其中以α-NA和β-NA為底物時的活性分別為對照的1.62和1.61倍,且與對照差異顯著(P<0.05)(圖6: C, D);而CYP450和GST活性與對照相比差異不顯著(P>0.05)(圖6: A, B)。

圖6 草地貪夜蛾UNSEL和Bro-SEL種群3齡幼蟲體內(nèi)3種解毒酶活力比較Fig. 6 Comparison of the detoxification enzyme activities in the 3rd instar larvae of the UNSEL and Bro-SEL populations of Spodoptera frugiperdaA: 細胞色素P450單加氧酶(CYP450)活性Cytochrome P450 monooxygenase (CYP450) activity; B: 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性Glutathione S-transferase (GST) activity; C: 羧酸酯酶(CarE)活性, 以α-NA為底物Carboxylesterase (CarE) activity using α-NA as the substrate; D: CarE活性, 以β-NA為底物CarE activity using β-NA as the substrate. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準誤(N=3); 柱上不同字母示差異顯著(P<0.05, 最小顯著差異法)。Data in the figure are mean±SE(N=3). Different letters above bars indicate significant difference(P<0.05, least significant difference test).

2.4 增效劑對溴蟲氟苯雙酰胺的增效作用

3種增效劑(PBO,TPP和DEM)對溴蟲氟苯雙酰胺有一定的增效作用(表4)。PBO和TPP與溴蟲氟苯雙酰胺混用后,能顯著地增加對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力,增效比分別為1.31和1.42。而DEM同溴蟲氟苯雙酰胺混用后,也能增加對草地貪夜蛾 3 齡幼蟲的毒力, 增效比為1.21; 但增效不顯著。

表4 在草地貪夜蛾3齡幼蟲的生測中增效劑對溴蟲氟苯雙酰胺的增效作用Table 4 Synergistic effects of synergists on boflanilide in bioassay against the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda

3 討論與結(jié)論

通過飼料表面涂毒法,對室內(nèi)草地貪夜蛾初孵幼蟲進行持續(xù)10代的定向強選擇,草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性升高緩慢。汰選10代后,與未汰選種群UNSEL相比,汰選種群Bro-SEL抗性倍數(shù)僅增加1.71倍(表1)。表明草地貪夜蛾長期接觸溴蟲氟苯雙酰胺,其敏感性變化較小,抗性水平仍處于敏感階段。這與Sun等(2022)的研究結(jié)果是一致的。小菜蛾經(jīng)過10代的持續(xù)選擇,對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性倍數(shù)僅為1.4倍。推測可能是由于溴蟲氟苯雙酰胺屬于新上市的殺蟲劑,在田間使用范圍少,所收集到的種群本身含有抗性遺傳基因少,從而影響其抗性發(fā)展。鑒于其對草地貪夜蛾優(yōu)異的防控效果和抗性發(fā)展緩慢,因此,溴蟲氟苯雙酰胺可作為田間應(yīng)急防控的替代藥劑。但在田間長期使用該藥劑防治草地貪夜蛾時,為延緩抗藥性的發(fā)生和最大限度地發(fā)揮其防治效果,需要長期跟蹤監(jiān)測其抗藥性發(fā)展?fàn)顩r,并注意與不同作用機理的藥劑進行輪換使用。

昆蟲抵抗殺蟲劑的重要途經(jīng)之一是體內(nèi)的解毒酶將殺蟲劑降解成無毒的物質(zhì)排除體外。齊浩亮等(2017)發(fā)現(xiàn),亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺能誘導(dǎo)小菜蛾體內(nèi)的CarE活性升高,但對多功能氧化酶和GST活性沒有影響;Zhan等(2021)研究發(fā)現(xiàn)溴蟲氟苯雙酰胺處理后的草地貪夜蛾體內(nèi)的多功能氧化酶、CarE和GST均能做出積極的響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)增效劑(PBO, TPP和DEM)與溴蟲氟苯雙酰胺一起使用能增加溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的毒力,表明多功能氧化酶、CarE和GST均能參與草地貪夜蛾體內(nèi)溴蟲氟苯雙酰胺的解毒代謝(表4)。同時,草地貪夜蛾經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后,體內(nèi)的CarE活性顯著升高,其中以α-NA和β-NA為底物時的活性分別為對照的1.62和1.61倍(圖6: C, D),但CYP450和GST活性無明顯變化(圖6: A, B)。說明,在草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的抗性發(fā)展中,CarE可能發(fā)揮著更加積極的作用。

長期接觸殺蟲劑時,昆蟲能通過一些行為、生理或遺傳機制來降低殺蟲劑的毒害,例如:通過組成型過表達解毒酶或在目標(biāo)位點誘導(dǎo)突變,但同時可能也給它們的種群帶來適合度代價,在發(fā)育和生殖方面產(chǎn)生負面影響((Kliot and Ghanim, 2012; Belinato and Martins, 2016)。因此,大多數(shù)殺蟲劑抗性機制都與適合度代價有關(guān),因為與敏感種群相比,這些變化往往對抗性昆蟲的整體適合度產(chǎn)生不利影響。Sun等(2022)發(fā)現(xiàn),小菜蛾經(jīng)10代汰選后,幼蟲期明顯延長,繁殖力沒有顯著變化,相對適合度為0.93。本研究發(fā)現(xiàn),草地貪夜蛾經(jīng)溴蟲氟苯雙酰胺10代汰選后,其發(fā)育歷期延長,幼蟲存活率和繁殖力降低,且其種群參數(shù)(內(nèi)稟增長率、周限增長率和凈增殖率)也降低,相對適合度為0.35,表現(xiàn)出適合度代價(表2, 3)。但同時也觀察到一些有利影響,如大蛹的比例相對提高和雌成蟲壽命顯著延長。這表明可能存在某種生理機制來補償相關(guān)的適合度代價(圖1)。另外,還發(fā)現(xiàn)雌成蟲生命期望值顯著延長2.96 d,這有利于增加汰選種群雌成蟲的產(chǎn)卵天數(shù)來補償產(chǎn)卵力下降(圖5)。

綜上所述,在連續(xù)10代汰選下,草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的代謝抗性發(fā)展緩慢,敏感性幾乎沒有變化。長期的藥劑汰選,草地貪夜蛾種群的發(fā)育與繁殖受到了一定程度的影響,表現(xiàn)出適合度代價。這些研究結(jié)果說明溴蟲氟苯雙酰胺在草地貪夜蛾的防治中將是一種重要的替代藥劑。盡管如此,為確保溴蟲氟苯雙酰胺的優(yōu)異防效,在田間使用時需要注意與不同作用機理的藥劑輪換使用。此外,盡管多功能氧化酶、CarE和GST均參與草地貪夜蛾體內(nèi)溴蟲氟苯雙酰胺的解毒代謝,但在抗性發(fā)展中,CarE可能起著更重要的作用。有關(guān)草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的代謝抗性需要進一步研究。