文│毛志福（昌吉州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心）

劉耀陽(yáng)（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

李斯特菌（Listeria Monocytogenes，LM）又被稱(chēng)為單核球增多性李斯特菌、李氏菌，是以約瑟夫李斯特的一個(gè)大名符號(hào)來(lái)進(jìn)行命名的。兼性厭氧細(xì)菌，革蘭氏陽(yáng)性，屬厚壁菌門(mén)。LM 基因組中存在多個(gè)毒力因子基因簇，其中毒力島4（Listeria monocytogenes pathogenicity island 4，LIPI-4）所編碼的蛋白在抑制藥物合理使用和抑制人體對(duì)抗病毒感染發(fā)病的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程起到了重要作用。筆者通過(guò)病理組織學(xué)觀察，進(jìn)一步闡述單增李斯特菌親本株和LIPI4缺失株對(duì)機(jī)體造成的病例反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，為深入研究載體致病發(fā)生機(jī)制和特種疫苗應(yīng)用載體研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

一、試驗(yàn)動(dòng)物與菌種

5周齡昆明系小白鼠20只、單增李斯特菌、缺失LIPI-4的李斯特菌（來(lái)源石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室）。

二、試驗(yàn)方法

1.細(xì)菌培養(yǎng)。將李斯特菌在增菌固體瓊脂上37℃，培養(yǎng)24小時(shí)，挑取單個(gè)菌落，37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24小時(shí)。反復(fù)挑菌增菌培養(yǎng)，直到固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出大小均勻，形狀相同的菌落，再進(jìn)行純化、感染小鼠。

2.小鼠感染。將小白鼠分成兩組（A、B），每組10只，A組每只小白鼠于腹腔接種約108國(guó)際單位/毫升的LIPI-4缺失李斯特菌；B組小白鼠注射等量的單增李斯特菌細(xì)菌，同樣條件飼喂。

3.組織采集。分別在感染后的24、48、72、96、120小時(shí)后，同時(shí)解剖兩組小鼠并采集的腦、肝、脾組織制作切片。

4.制作切片。采樣的組織用福爾馬林固定、石蠟切片制作、HE染色、顯微鏡觀察。

三、試驗(yàn)結(jié)果

1.腦組織切片。觀察顯示：LIPI-4缺失李斯特菌（A組）感染24小時(shí)，腦組織切片未見(jiàn)異常。單增李斯特菌親本株（B組）感染24小時(shí)，腦組織部分腦膜血管及脈絡(luò)叢血管擴(kuò)張，內(nèi)充滿(mǎn)紅細(xì)胞，血管外圍也有紅細(xì)胞；感染72小時(shí)腦組織部分小血管外圍和部分神經(jīng)元外圍有較大間隙。

2.肝組織切片。觀察顯示：LIPI-4缺失李斯特菌（A組）感染48～96小時(shí)肝組織表現(xiàn)正常。單增李斯特菌親本株（B組）感染后48小時(shí)，肝組織大部分小葉中央靜脈擴(kuò)張；感染后72小時(shí)，肝組織個(gè)別視野可見(jiàn)數(shù)個(gè)藍(lán)染區(qū)域，區(qū)域內(nèi)肝組織結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)有中性粒白細(xì)胞及壞死崩解的中性粒白細(xì)胞碎片，及淋巴細(xì)胞和壞死的肝細(xì)胞；感染后96小時(shí)，肝組織個(gè)別視野可見(jiàn)淡染區(qū)，淡染區(qū)內(nèi)肝細(xì)胞核溶解消失；感染120小時(shí)，肝組織部分區(qū)域小葉中央靜脈及竇狀隙充滿(mǎn)紅細(xì)胞。

3.脾組織切片。觀察顯示：LIPI-4缺失李斯特菌感染后24、72、96小時(shí)，均顯示脾組織內(nèi)部分脾小結(jié)體積增大，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但脾小體輪廓清晰，未出現(xiàn)淋巴細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。單增李斯特菌親本株（B組）感染后72小時(shí)，脾部分脾小結(jié)內(nèi)出現(xiàn)淡染區(qū)，淡染區(qū)內(nèi)淋巴細(xì)胞核溶解、消失；感染后96小時(shí)，脾大部分脾小體輪廓不清晰，出現(xiàn)淡染區(qū)，淋巴細(xì)胞核完全溶解、消失。

四、結(jié)果分析

1.單增李斯特菌親本株感染的腦、肝、脾組織。在腹腔注射單增李斯特菌親本株后，觀察不同時(shí)間病理組織切片發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌親本株感染24小時(shí)后腦呈現(xiàn)出部分腦膜血管及脈絡(luò)叢血管擴(kuò)張，內(nèi)充滿(mǎn)紅細(xì)胞，血管外圍也有紅細(xì)胞。單增李斯特菌親本株感染72小時(shí)后腦呈現(xiàn)部分小血管外圍和部分神經(jīng)元外圍有較大間隙。由此可以得出結(jié)論，單增李斯特菌親本株對(duì)小鼠腦有較大影響，可引發(fā)急性腦炎等疾病。

在感染后48小時(shí)，肝呈現(xiàn)大部分小葉中央靜脈擴(kuò)張，72小時(shí)后肝呈現(xiàn)數(shù)個(gè)化膿灶，96小時(shí)后肝呈現(xiàn)為個(gè)別可見(jiàn)淡染區(qū)，淡染區(qū)內(nèi)肝細(xì)胞核溶解消失，120小時(shí)后肝呈現(xiàn)部分區(qū)域小葉中央靜脈及竇狀隙充滿(mǎn)紅細(xì)胞。由此可以得出結(jié)論，單增李斯特菌親本株對(duì)小鼠的肝有較大影響，會(huì)使肝細(xì)胞核溶解，引起化膿性肝炎等疾病。

在感染后72小時(shí)，脾表現(xiàn)為部分脾小結(jié)內(nèi)有淡染區(qū)，淡然區(qū)內(nèi)淋巴細(xì)胞核溶解、消失；96小時(shí)后脾表現(xiàn)為大部分脾小體出現(xiàn)淡染區(qū)，淡染區(qū)淋巴細(xì)胞核溶解，消失，說(shuō)明該處的T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死現(xiàn)象，所以單增李斯特菌親本株感染會(huì)引起壞死性脾炎，主要是細(xì)胞免疫反應(yīng)受到損傷。

2.LIPI-4缺失李斯特菌感染后感染的腦、肝、脾組織。LIPI-4缺失李斯特菌感染后24～48小時(shí)，腦組織和肝組織未見(jiàn)異常。感染后96小時(shí)肝呈現(xiàn)部分區(qū)域淡染，但區(qū)域內(nèi)肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞、中性粒、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均未見(jiàn)壞死溶解現(xiàn)象，說(shuō)明LIPI-4缺失李斯特菌對(duì)機(jī)體無(wú)損傷。

感染后24小時(shí)，脾表現(xiàn)為部分脾小體體積增大，該處淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增多，主要體現(xiàn)了T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫反應(yīng)，感染后72、96小時(shí)，脾未見(jiàn)異常，說(shuō)明LIPI-4缺失李斯特菌，機(jī)體產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，單位對(duì)機(jī)體重要組織產(chǎn)生損害。

五、結(jié)論

通過(guò)觀察到的切片可以發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌親本株可以引起腦炎、化膿性肝炎、壞死性脾炎、破壞淋巴細(xì)胞，影響細(xì)胞免疫反應(yīng)。LIPI-4缺失的李斯特菌感染小鼠后，小鼠的脾和肝都呈現(xiàn)出正常，說(shuō)明缺失LIPI-4基因片段后的李斯特菌對(duì)于肝和脾的損傷顯著降低，對(duì)于機(jī)體機(jī)能基本無(wú)影響。李斯特菌的LIPI-4基因片段的表達(dá)對(duì)其致病性和李斯特菌在細(xì)胞內(nèi)增值有著較大影響。有研究表明，組成LIPI-4的6個(gè)基因涉及20多種不同生物細(xì)胞碳水化合物和糖醇的磷酸化和糖醇以及跨磷酸酶的多種膜透和活性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)，李斯特菌可以通過(guò)LIPI-4調(diào)節(jié)細(xì)菌遷移速率及細(xì)胞內(nèi)增值而降低細(xì)菌毒力。試驗(yàn)中缺失株感染后小鼠脾小體體積增大可以得出，說(shuō)明小鼠機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)主要由T淋巴細(xì)胞參與，表明在一定程度上可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。

單增李斯特菌可通過(guò)動(dòng)物口腔、食物接觸到動(dòng)物糞便的多種途徑可以進(jìn)行感染傳播，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都易感。臨床表現(xiàn)為膿毒癥，腦膜炎，病理表現(xiàn)為單核細(xì)胞增多。該細(xì)菌在4℃時(shí)能夠健康存活并繁殖，是通過(guò)冷藏食品而導(dǎo)致食源傳染性疾病的主要原因之一，因此，食品行業(yè)監(jiān)管部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)，尤其是半開(kāi)放包裝且需長(zhǎng)期存放或運(yùn)輸?shù)氖称?。在人們?nèi)粘Ｉ钪?，用冰箱長(zhǎng)期冷凍生肉、海鮮，4℃冷藏即食熟食或剩菜剩飯等經(jīng)常出現(xiàn)，這也大大增加了李斯特菌的感染風(fēng)險(xiǎn)。

李斯特菌是一種胞內(nèi)寄生菌，從細(xì)胞反應(yīng)機(jī)理來(lái)看，機(jī)體被感染后，單增李斯特菌緊黏在巨噬細(xì)胞和腸細(xì)胞上并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞出現(xiàn)增生，釋放細(xì)菌性質(zhì)過(guò)氧化物歧化酶，來(lái)對(duì)抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的各種過(guò)氧化物對(duì)其的分解，同時(shí)產(chǎn)生溶血素（即李氏桿菌溶血素O），對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生損害。感染后的機(jī)體主要依靠自身的免疫細(xì)胞和免疫抑制功能進(jìn)行免疫消除。而LIPI4是單增李斯特菌的毒力基因。因此，構(gòu)建LIPI4基因缺失株作為新的優(yōu)良流感疫苗注射載體研發(fā)打下重要基礎(chǔ)。