杜松麗,樊 莉,陳茂山,周 戀,華幫江,楊宏偉,

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099;2.遂寧市中心醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，四川 遂寧 629000)

全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位，占所有惡性腫瘤的24.5%，嚴(yán)重危害女性身心健康[1]。乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，根據(jù)腫瘤表達(dá)的ER、PR和HER2狀態(tài)可將乳腺癌劃分為Luminal A樣、Luminal B樣、HER2陽性和三陰性4種亞型，不同亞型乳腺癌的生物學(xué)行為及預(yù)后存在顯著差異。Luminal A樣和Luminal B樣型乳腺癌統(tǒng)稱為激素受體(Hormone receptor, HR)陽性乳腺癌，在乳腺癌中占比為60%～70%[2]。內(nèi)分泌治療(Endocrinetherapy, ET)是該類型乳腺癌的重要治療方式，能顯著提高HR陽性乳腺癌患者的預(yù)后，然而約30%的HR陽性乳腺癌患者在內(nèi)分泌治療過程中出現(xiàn)耐藥導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，能預(yù)測HR陽性乳腺癌發(fā)生ET耐藥的標(biāo)志物和能逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點，為進(jìn)一步提高HR陽性患者的預(yù)后具有非常重要臨床意義。

隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，能為腫瘤等各種疾病深入了解基因?qū)用娴牟町惡烷_展機(jī)制研究，為臨床診斷、治療、預(yù)后評估等方面提供非常重要的信息[3-4]。高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫涵蓋世界各機(jī)構(gòu)提交的各種腫瘤的基因芯片數(shù)據(jù)，為乳腺癌ET耐藥問題的深入研究提供了可能。目前，乳腺癌ET耐藥的具體機(jī)制尚不清楚。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥差異基因分析，探索耐藥可能相關(guān)的信號通路，并通過臨床標(biāo)本進(jìn)行初步驗證。本研究通過遂寧市中心醫(yī)院科研倫理委員會審批(編號：LLSLH20210060)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的選擇 本研究使用美國國立生物技術(shù)信息中心的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，采用“breast cancer”和“endocrine therapy”為關(guān)鍵詞在數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行檢索，獲得乳腺癌內(nèi)分泌治療相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)。篩選得到他莫昔芬耐藥和他莫昔芬非耐藥細(xì)胞系的基因數(shù)據(jù)集(GSE 67916)，芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系和芳香化酶抑制劑非耐藥細(xì)胞系的基因數(shù)據(jù)集(GSE 51390)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選 采用 GEO2R篩選對HR陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療敏感組與耐藥組的差異表達(dá)基因(DEGs)。以調(diào)整后P<0.05、|logFC|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。然后，運用Venn diagram軟件獲取兩個基因芯片的共同DEGs。logFC≥1定義為上調(diào)基因，logFC≤-1定義為下調(diào)基因。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 采用STRING(Search tool for the retrieval of interacting genes/proteins)對DEGs進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)分析。進(jìn)一步運用 Cytoscape 3.8.0(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行蛋白之間的潛在相關(guān)性分析，篩選出與周圍蛋白有高度連通性(度值degree)的前20個蛋白。

1.4 差異基因的生物功能及作用通路分析 采用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(The database for annotation,visualization,and integrated discovery,DAVID)對篩選的前20個蛋白對應(yīng)的DEGs進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，了解基因的作用及相關(guān)通路。

1.5 關(guān)鍵基因的生存分析 運用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(http://www.kmplot.com/analysis/)對篩選出的20個關(guān)鍵蛋白對應(yīng)的基因進(jìn)行預(yù)后分析，確定其與HR陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存(Recurrence-free survival,RFS)的相關(guān)性，并繪制生存曲線。

1.6 差異基因蛋白表達(dá)的驗證 選取遂寧市中心醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中病例及對應(yīng)的石蠟標(biāo)本，采用免疫組化(IHC)法檢測篩選出的20個關(guān)鍵蛋白，驗證分析蛋白在乳腺內(nèi)分泌治療敏感和耐藥人群中的表達(dá)情況。具體方法如下：

1.6.1 標(biāo)本的選擇 在本中心數(shù)據(jù)庫中初篩接受規(guī)范診療、有隨訪信息及病理標(biāo)本的HR陽乳腺癌病例，再利用隨機(jī)數(shù)字表法按1∶1篩選ET敏感和耐藥病例各21例。于病理科借取相應(yīng)患者的原發(fā)灶手術(shù)石蠟標(biāo)本或穿刺石蠟標(biāo)本。

1.6.2 主要試劑 一抗、二抗、EDTA修復(fù)液(免疫組化法)、DAB顯色液、緩沖液(PBS磷酸鹽法)、蘇木素等。

1.6.3 免疫組化Enivision法染色 將存檔的非特殊浸潤性乳腺癌組織蠟塊2 μm厚連續(xù)切片制作載玻片，室溫TO液脫蠟后PBS液及EDTA修復(fù)液處理，分別用一抗、二抗處理后DAB顯色，蘇木素復(fù)染微波爐烤片后加入細(xì)胞保存液封片。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

1.6.4 實驗結(jié)果評判 由兩位工作5年以上的副主任醫(yī)師盲態(tài)下獨立閱片，參照《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]，在400倍高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個視野，根據(jù)相應(yīng)抗體的表達(dá)部位進(jìn)行判讀。染色強(qiáng)度評分：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性的細(xì)胞占比評分：0為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%計4分。將兩個評分乘積作為該視野的IHC得分。計算兩位醫(yī)師評出的每個視野的平均分作為該視野最終得分。每個標(biāo)本的5個視野平均分，作為該標(biāo)本的IHC最終得分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合者采用Wilcoxon秩和檢驗。分類變量組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。采用單因素Logistic回歸分析ET耐藥可能相關(guān)的因素，單因素分析P<0.05的變量進(jìn)入多因素Logistic回歸分析耐藥獨立相關(guān)因素。生存分析采用Kaplan-Meier法，各基因不同表達(dá)水平患者間的RFS比較采用log-rank檢驗。所有檢驗均為雙側(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選 按照“Breast cancer”和“Endocrine therapy resistance”在GEO數(shù)據(jù)庫共檢索到168個相關(guān)芯片數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步精確篩選后得到GSE 67916和GSE 51390兩個數(shù)據(jù)集，其中GSE 67916對他莫昔芬耐藥細(xì)胞系TamR與他莫昔芬敏感細(xì)胞系MCF7/S0.5進(jìn)行了基因陣列分析，進(jìn)行差異基因分析獲得1 787個DEGs；GSE 51390檢測了對芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)3與敏感細(xì)胞系T-47D的基因表達(dá)，差異基因分析獲得5 665個DEGs。兩個數(shù)據(jù)集DEGs的火山圖分別見圖1～2。進(jìn)一步運用Venn diagram在線工具對兩個數(shù)據(jù)集的 DEGs取交集。得到同時在他莫昔芬耐藥和芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系表達(dá)的基因，繪制韋恩圖(見圖 3)。最終篩選出184個DEGs，其中上調(diào)基因68個，下調(diào)基因116個。

圖1 GSE 67916 差異表達(dá)基因

圖2 GSE 51390差異表達(dá)基因

A：68個上調(diào)基因；B：116個下調(diào)基因。圖3 184個共同的差異表達(dá)基因

2.2 差異基因的富集分析

2.2.1 GO分析 使用DAVID對184個DEGs進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示：(1)在細(xì)胞組分上，主要富集于細(xì)胞膜、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、胞外外泌體等處(見圖4)；(2)在生物學(xué)過程中，主要在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附等方面富集(見圖5)；(3)在分子功能上，主要在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等方面富集(見圖6)。

圖4 細(xì)胞組分

圖5 生物過程

圖6 分子功能

2.2.2 KEGG分析 KEGG分析(見圖7)，DEGs在癌細(xì)胞中主要富集于蛋白聚糖、鈣信號通路、Rap1信號通路、催產(chǎn)素信號通路、細(xì)胞粘附分子、甲狀腺激素信號通路等通路。

圖7 KEGG富集通路分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 用184個共同DEGs在STRING數(shù)據(jù)庫初步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，獲得各基因相應(yīng)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的信息。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中運用cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行運算，按Degree 算法選擇蛋白質(zhì)之間相互作用最密切的前20個蛋白(見圖8；表1)，并將這20個蛋白及對應(yīng)的基因為研究對象。

圖8 前20個蛋白質(zhì)互作關(guān)系

2.4 關(guān)鍵基因的生存分析 運用Kaplan-Meier plotter中乳腺癌數(shù)據(jù)庫患者生存資料對篩選出的20個基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明20個關(guān)鍵基因中有11個基因與HR陽性患者的RFS呈相關(guān)性(P均<0.05)，其中基因和基因等基因高表達(dá)的患者RFS更短(P均<0.05)，表明這2個基因可能是HR陽性乳腺癌疾病進(jìn)展的危險因素；而PTPN11、ITPR1、GATA3、PLCG2、ESR1、ERBB4、TP53、FGFR2 及PGR這9個基因高表達(dá)則可能是乳腺癌患者疾病進(jìn)展的保護(hù)性因素(P均<0.05,見圖9)。

表1 前20個樞紐基因

2.5 對差異基因行免疫組化驗證 閱讀文獻(xiàn)及結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，IHC方法檢測乳腺癌組織中ITPR1、FGFR2相應(yīng)的蛋白，結(jié)果極少陽性表達(dá)甚至不表達(dá)[6]。已有文獻(xiàn)證實ESR1、CD24基因與乳腺癌內(nèi)分泌耐藥相關(guān)[7]。本研究對上述4個蛋白未重復(fù)驗證。結(jié)合查閱文獻(xiàn)，本研究選取ERBB4、PTPN11、GATA3、TP53、PGR、PLCG2和SDC1基因相應(yīng)的蛋白進(jìn)行IHC檢測。結(jié)果顯示：PGR、PLCG2和SDC1基因蛋白在ET敏感和耐藥兩組之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，TP53、ERBB4、GATA3和PTPN11基因蛋白在兩組之間的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，見圖10)，并通過免疫組織化學(xué)法驗證各差異基因在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(見圖11～17)。

7個基因敏感組與耐藥組相比，P值分別為0.033、0.008、0.460、0.213、0.793、0.082。圖10 7個基因相應(yīng)蛋白驗證結(jié)果

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖11 IHC法檢測PGR在乳腺癌中的表達(dá)

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖12 IHC法檢測PLCG2在乳腺癌中的表達(dá)

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖13 IHC法檢測SDC1在乳腺癌中的表達(dá)

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖14 IHC法檢測TP53在乳腺癌中的表達(dá)

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖15 IHC法檢測GATA3在乳腺癌中的表達(dá)

A：陰性表達(dá)；B：陽性表達(dá)，×200。圖17 IHC法檢測ERBB4在乳腺癌中的表達(dá)

3 討論

激素受體(Hormone receptor, HR)陽性乳腺癌的預(yù)后與基因表達(dá)情況密切相關(guān)，如ESR1基因、PIK3CA/mTOR通路的改變，抑制CDK4/6、mTOR和PI3K等通路均顯示可提高內(nèi)分泌治療(Endocrine therapy, ET)的臨床療效。但仍有部分HR陽性乳腺癌對內(nèi)分泌不夠敏感，出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性ET耐藥。目前，ET耐藥的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。本研究利用生物信息技術(shù)從GEO數(shù)據(jù)庫篩選出GSE67916和GSE51390芯片，對可能與乳腺癌ET耐藥密切的基因和蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SDC1和CD24基因高表達(dá)與HR陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存(Recurrence-free survival, RFS)更差相關(guān)(P均<0.05)，同時發(fā)現(xiàn)PTPN11、ITPR1、GATA3、PLCG2、ESR1、ERBB4、TP53、FGFR2及PGR這9個基因高表達(dá)則與患者更優(yōu)的RFS相關(guān)(P均<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)的這11個基因及蛋白有可能為預(yù)測HR陽性乳腺癌ET敏感性提供參考信息。

SDC1(Syndecan-1)是一種細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通常主要由上皮細(xì)胞和漿細(xì)胞表達(dá)，在乳腺癌的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中異常表達(dá)，可存在于各種正常和惡性組織中。SDC1在乳腺癌微環(huán)境中存在特定于生態(tài)位的功能，介導(dǎo)Wnt級聯(lián)信號并可能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移[8]，它主要通過影響腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)配體和受體而影響腫瘤進(jìn)展。SDC1的高表達(dá)被證明是乳腺癌的一個新的獨立預(yù)后因素，SDC1過表達(dá)與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)血腦屏障的相關(guān)細(xì)胞因子促使乳腺癌細(xì)胞跨血腦屏障遷移而促進(jìn)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[9]。SDC1基因參與調(diào)控的PI3K/AKT信號通路在乳腺癌內(nèi)分泌耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[10]。

PLCG2(Phospholipase Cγ2)與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和腫瘤生長的調(diào)節(jié)有關(guān)，在三陰性型乳腺癌中PLCG2表達(dá)上調(diào)[11]。大部分關(guān)于PLCG2的研究主要與阿爾茲海默病、消化道腫瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病耐藥等領(lǐng)域。與原發(fā)腫瘤相比，PLCG2是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移中表達(dá)差異最大的基因之一，且與乳腺原發(fā)腫瘤相比，PLCG2mRNA在淋巴轉(zhuǎn)移中的數(shù)量增加[12-13]，這可能預(yù)示PLCG2表達(dá)與更具侵襲性的分子亞型相關(guān)。

ERBB4是ERBB受體酪氨酸激酶家族的成員，它在腫瘤不同微環(huán)境狀態(tài)下中具有促癌和抗癌活性。ERBB4負(fù)調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞中的血管生成擬態(tài)(VM)的形成，其突變點可能成為乳腺癌的有效治療靶標(biāo)[14]。Kawahara等[15]學(xué)者探討ERBB4在人類腫瘤中作為生物標(biāo)志物發(fā)揮作用的可能性，分析ERBB4在人類腫瘤分期中的潛在作用以及ERBB4功能如何決定人類腫瘤的治療，均表明本研究所篩選出的ERBB4基因?qū)φ{(diào)節(jié)人類腫瘤微環(huán)境起重要作用。

PGR由位于11q22.1的PGR基因編碼，在乳腺的發(fā)育以及乳房的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Hisham等研究結(jié)果表明，在雌激素允許的條件下，激活的PR通過重新定向ERα染色質(zhì)結(jié)合和改變靶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞從增殖狀態(tài)向分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，在ER乳腺腫瘤中起增殖抑制作用[16]。PGR基因組位點的基因組改變使PR表達(dá)降低從而增加乳腺癌的風(fēng)險的一種相對常見的機(jī)制，這可能導(dǎo)致ERα染色質(zhì)結(jié)合和靶基因表達(dá)模式的改變，PGR還可以調(diào)節(jié)ER結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄活性，選擇性PR調(diào)節(jié)劑藥物可以與他莫昔芬協(xié)同作用，使小鼠腫瘤消退[16-17]。在本研究中，PGR在內(nèi)分泌治療耐藥組與敏感組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證實PGR與乳腺癌ET耐藥相關(guān)。

ESR1、PTPN11、TP53和ITPR1等基因與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)移性激素受體陽性乳腺癌中，ESR1突變是繼發(fā)耐藥的常見原因[18]，可見ESR1基因是降低HR陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的潛在保護(hù)基因。PTPN11在急性髓系粒細(xì)胞白血病(AML)中RAS信號超激活、白血病轉(zhuǎn)化及化學(xué)耐藥等信號通路中皆具有重要作用[19]。TP53的突變是導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移極重要的遺傳變化，5%～8%的30歲以下患有乳腺癌的女性帶有種系TP53基因突變，而攜帶TP53基因種系突變的女性在60歲時患乳腺癌的風(fēng)險高達(dá)85%，與患者不良預(yù)后高度相關(guān)[20]。

本研究通過生物信息技術(shù)篩選出可能與乳腺癌ET敏感性相關(guān)的基因，通過單中心病理標(biāo)本初步驗證證實SDC1、PLCG2、ERBB4、PGR、ESR1、PTPN11、TP53和ITPR1等基因可能為乳腺癌ET敏感性提供參考信息。受限于基因數(shù)據(jù)庫信息的局限性，仍存在乳腺癌耐藥基因篩選不全、基因或蛋白在信號通路間的交互作用、基因差異與現(xiàn)實中患者ET敏感性不吻合等情況，后續(xù)將進(jìn)一步對本研究發(fā)現(xiàn)的耐藥基因和蛋白進(jìn)行深入研究和機(jī)制探索。