蔣玲艷，張 在，于 樂，秦張善，王林果

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術大學 動物科技學院，廣西南寧 530007；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471000）

微生態(tài)制劑具有降低病原體入侵或定植引起疾病的風險，分泌病毒捕捉顆粒，降低病毒的傳染性，提高動物免疫能力、生產(chǎn)性能等多種功能，正在成為抗生素替代品，廣泛用于動物生產(chǎn)。目前應用于改善雞生產(chǎn)性能、免疫性能的益生菌種類較多，包括乳桿菌、分支桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、丁酸梭菌等。但益生菌調(diào)節(jié)雞的生長性能和免疫性能的效果跟多種因素有關，需要進行詳細研究（簡宗輝等，2021；劉珂飛等，2021；Alquazlan等，2021）。丁酸梭菌屬于厭氧型芽孢梭菌，存在于人和動物腸道，具有耐胃酸、耐高溫、耐多種抗生素，且能提高機體免疫力、改善腸道組織結(jié)構、促進消化吸收、維持腸道屏障能力等功能，作為一種新型綠色的微生態(tài)制劑，已成為人們研究的熱點，并廣泛應用于人類疾病治療及動物養(yǎng)殖生產(chǎn)上（王宗偉等，2022；范雪等，2021；Stoeva等2021）。禽流感（Avian influenza，AI）和新城疫（Newcastle disease，ND）是危害養(yǎng)雞業(yè)的兩種主要急性傳染病。禽流感病毒不單攻擊呼吸道，還會對雞的腸道造成破壞，導致雞腸道黏膜上皮細胞連接方式發(fā)生改變，產(chǎn)生嚴重的繼發(fā)感染。疫苗免疫是目前預防雞免遭這些傳染病侵襲的重要手段之一，但由于病毒毒力變異及各種因素的影響，疫苗免疫難以完全有效控制這些傳染病的爆發(fā)，因此，疫苗接種聯(lián)合益生菌使用會成為這些疾病的綜合防控途徑。本試驗聯(lián)合新城疫病毒-禽流感病毒滅活疫苗免疫和丁酸梭菌的使用，研究分析了丁酸梭菌對雞生長性能和體液免疫的影響，為科學應用丁酸梭菌飼養(yǎng)肉雞及綜合防控雞新城疫和禽流感提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及免疫 試驗將90只1日齡健康麻黃肉雞（購自廣西富鳳農(nóng)牧集團）隨機分成3組，每組3個重復，每個重復10只雞，采取單層籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)在本校動物養(yǎng)殖場，自由采食與飲水，試驗為期84 d。對照組飼喂基礎日糧，試驗組飼喂基礎日糧+丁酸梭菌（低劑量2×105CFU/g和高劑量5×105CFU/g）。各組雞分別于1和21日齡頸部皮下接種新城疫病毒-禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗 0.3 mL/只。

1.2 試驗試劑 丁酸梭菌網(wǎng)購自佳美生物，活菌 數(shù) 5億 CFU/g。 新 城 疫 病 毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗（批號為160022133），由普萊柯生物工程有限公司提供。新城疫血凝抑制試驗用抗原、陽性血清與陰性血清（批號為154028082），購自青島立見生物科技有限公司。小雞基礎日糧（破碎顆粒料）：漓源小雞配合飼料121T（3周齡內(nèi)）和511（3周齡以上），購自南寧市元亨獸醫(yī)服務中心。

1.3 免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)的測定 分別于21、42、63、84日齡時每組隨機挑取 3只雞，分別稱量個體活重，然后屠宰分離出脾、胸腺、法氏囊，稱量三者總重量，計算免疫器官指數(shù)。同時分離出十二指腸、空腸、回腸和盲腸、直腸，除去腸中內(nèi)容物后稱量每只雞整個腸道的重量，計算腸道指數(shù)，具體公式如下：

腸道指數(shù)/%=個體腸道總重量/個體活重×100；

免疫器官指數(shù)/%=個體免疫器官總重量/個體活重×100。

1.4 日增重、日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率的測定 每3周稱量一次雞只體重和飼料消耗量，計算雞只平均體重和平均飼料消耗量，然后計算日增重和日采食量，并計算飼料轉(zhuǎn)化率，具體公式如下：

飼料轉(zhuǎn)化率/%=平均日增重/平均日采食量×100。

1.5 血清分離 二免疫后14 d起，每周固定時間分別從對照組和試驗組雞群中隨機采集6只雞翅靜脈血，待血液凝固后收集血清，于3000 rpm離心5 min，保存上清液，用于新城疫抗體（Newcastle disease antibody，ND Ab） 和 禽流 感 H9亞 型 抗 體（Avian influenza H9subtype antibody，AI H9Ab）效價測定，連續(xù)采集血清 8 周。

1.6 新城疫抗體（ND Ab）和禽流感抗體（AI H9Ab）的測定 用血凝試驗和血凝抑制試驗（Hemagglutination inhibition test，HI）測 定 ND Ab效價和 AI H9Ab效價。ND Ab效價測定按照國家標準《新城疫診斷技術》（GB/T16550-2020）執(zhí)行，記錄測定數(shù)據(jù)，計算HI（log2）結(jié)果平均值。AI H9Ab效價由廣西璞締恩葳生物科技有限公司一次性全部檢測。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel整理后，使用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用t檢驗，P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對免疫器官指數(shù)與腸道指數(shù)的影響 由表1可知，21日齡雞丁酸梭菌高劑量（5×105CFU/g）組免疫器官指數(shù)稍高，各組雞的免疫器官重量指數(shù)均在42日齡時最高，其中對照組最高，但丁酸梭菌低劑量（2×105CFU/g）組和高劑量組無顯著差異（P＞0.05），整個試驗期間隨日齡的增加，對照組和試驗組雞的免疫器官指數(shù)變化趨勢基本一致，且同日齡階段各組免疫器官指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。各組雞腸道指數(shù)隨日齡增加呈下降趨勢，21日齡時腸道指數(shù)最高，之后逐漸下降。21日齡時，丁酸梭菌低劑量組和高劑量組雞的腸道指數(shù)均高于對照組（P＞0.05），21～63日齡丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)高于丁酸梭菌高劑量組和對照組，但各組之間無顯著差異（P＞0.05）。84日齡時，丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)明顯低于對照組（P＜0.01），丁酸梭菌高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 丁酸梭菌對肉雞免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)的影響 %

2.2 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響 由表2可知，整體看，對照組和試驗組雞只在前3周內(nèi)生長最慢，日增重最少，但飼料轉(zhuǎn)化率較高，之后生長速度加快，21～42日齡日增重最快。0～21日齡，對照組的平均日增重顯著高于試驗組（P＜0.05），丁酸梭菌低劑量和高劑量組雞平均日增重無顯著差異（P＞0.05）；0～21日齡對照組飼料轉(zhuǎn)化率極顯著高于丁酸梭菌低劑量組（P＜0.01），與丁酸梭菌高劑量組無顯著差異（P＞0.05），且丁酸梭菌高劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于低劑量組（P＜0.01）。21～42日齡，丁酸梭菌高劑量組日增重顯著高于低劑量組和對照組（P＜0.05），飼料轉(zhuǎn)化率極顯著高于低劑量組和對照組（P＜0.01），對照組日增重和飼料轉(zhuǎn)化率與丁酸梭菌低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。42～63日齡，丁酸梭菌低劑量組日增重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組和高劑量組（P＜0.05），丁酸梭菌高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。63～84日齡，丁酸梭菌低劑量組和高劑量組的日增重與對照組無顯著差異（P＞0.05），低劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組和高劑量組（P＜0.05），高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。整體看，丁酸梭菌對雞生長性能的影響與雞的日齡和添加丁酸梭菌的量有關。與對照組相比，除前三周外，在飼料中添加丁酸梭菌可以提高雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。42日齡前在肉雞飼料中添加高劑量（5×105CFU/g）丁酸梭菌組的飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于低劑量（2×105CFU/g）組（P＜0.05）；42日齡后添加丁酸梭菌低劑量的飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于高劑量組和對照組（P＜0.05），高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。三組雞的終末平均體重基本一致，丁酸梭菌低劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組（P＜0.05），與高劑量組無顯著差異（P＞0.05），添加丁酸梭菌組平均日采食量低于對照組。

表2 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

2.3 丁酸梭菌對肉雞體液免疫應答能力的影響為研究丁酸梭菌對雞體液免疫應答能力的影響，對照組和試驗組雞全部于1和21日齡頸部皮下接種新城疫病毒-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗。第二次免疫后14 d開始，每周定期采血分離雞血清，用HI試驗測定新城疫抗體（ND Ab）效價和禽流感H9亞型抗體（AI H9Ab）效價，計算HI（log2）平均值。由表3可知，二次免疫后14 d時，對照組ND Ab和AI H9Ab的平均效價均高于丁酸梭菌組，但與丁酸梭菌組差異不顯著（P＞0.05）。丁酸梭菌低劑量組和對照組在二免35 d時ND Ab和AI H9Ab平均效價均達到最高值，兩組的ND Ab平均效價最高值一致，均為9.7 log2，但丁酸梭菌低劑量組的AI H9Ab平均效價最高達到 10.7 log2，極顯著高于對照組的 9.0 log2（P＜0.01），而對照組AI H9Ab平均效價顯著高于丁酸梭菌高劑量組（P＜0.05）。二免28 d后，丁酸梭菌低劑量組的ND Ab和AI H9Ab的平均效價均高于對照組和高劑量組，高劑量組略低于對照組（P＞0.05）。在整個試驗期間，各組血清ND Ab和AI H9Ab平均效價變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)出一定的波動，在二次免疫后的63 d內(nèi)無明顯的規(guī)律性，其中丁酸梭菌高劑量組的ND Ab和AI H9Ab效價最高值和整體平均效價均低于對照組（P＞0.05），而丁酸梭菌低劑量組的ND Ab和AI H9Ab效價在達到最高值后平均效價稍高于對照組（P ＞ 0.05）。

表3 丁酸梭菌對肉雞體液免疫應答能力的影響

3 討論

丁酸梭菌為革蘭氏陽性厭氧桿菌，具有促進腸道有益菌群增殖、發(fā)育，抑制有害菌繁殖，產(chǎn)生多種維生素等作用，其主要代謝產(chǎn)物丁酸是腸道上皮組織細胞再生和修復的主要營養(yǎng)物質(zhì)，不受胃酸、膽汁酸等影響，作為新飼料添加劑在動物養(yǎng)殖方面廣泛應用（范雪等，2021）。試驗結(jié)果表明，21日齡內(nèi)的肉雞，與對照組比較，在飼料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可稍微提高免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，為后期營養(yǎng)消化、吸收和體液免疫打好生理基礎。但試驗持續(xù)到84日齡時發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)低于對照組和高劑量組，具體原因需要進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可增加幼禽腸道重量指數(shù)，并不是增加腸道長度，而是增加了腸道絨毛的長度和厚度（李修宇等，2021；蔣一秀等，2021；韋曉芳等，2021）。因此，21日齡后在飼料中添加2×105～5×105CFU/g丁酸梭菌能顯著提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，與武麗達等（2022）的研究結(jié)果基本一致。從84 d的試驗期看，在42日齡內(nèi)的肉雞飼料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可以改善雞的免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，提高飼料轉(zhuǎn)化率。對于42日齡以上的肉雞，日糧中添加2×105CFU/g丁酸梭菌對日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的效果優(yōu)于添加5×105CFU/g丁酸梭菌。長期在飼料中添加丁酸梭菌對麻黃肉雞的終末體重影響不顯著，但可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

由表3可知，試驗組在二次免疫14 d的ND Ab和AI H9Ab平均效價均低于對照組，且個體差異比較大，存在效價低于免疫臨界值4 log2的個體（1/6），可能跟拌料均勻度有關。二次免疫21 d后，各組新城疫和禽流感H9個體免疫率和群體免疫率均達到100%。二次免疫35 d后，丁酸梭菌低劑量組和對照組的ND Ab和AI H9Ab平均效價均達到最高值，且丁酸梭菌低劑量組的AI H9Ab最高效價明顯高于其他兩組，而丁酸梭菌高劑量組的ND Ab和AI H9Ab峰值低于其他兩組，且沒有明顯峰值。表明在麻黃肉雞飼料中添加合適劑量（2×105CFU/g）的丁酸梭菌能提高雞對新城疫和AI H9滅活疫苗的免疫應答能力，從而提高抗體效價和抗體持續(xù)時間。而在飼料中添加高劑量（5×105CFU/g）的丁酸梭菌反而對雞的體液免疫應答能力沒有正向效果，從而導致血清抗體效價不高，其機理需要進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，在42日齡內(nèi)的肉雞飼料中添加高劑量5×105CFU/g的丁酸梭菌可改善免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。對于42日齡以上的肉雞，飼料添加低劑量2×105CFU/g的丁酸梭菌對雞日增重、飼料轉(zhuǎn)化率和體液免疫應答能力等綜合性能的提高較好，且能提高麻黃肉雞滅活疫苗免疫后的AI H9Ab峰值和持續(xù)時間，而高劑量5×105CFU/g的丁酸梭菌對麻黃肉雞的新城疫和禽流感疫苗的體液免疫應答沒有提高作用。因此，丁酸梭菌對家禽生長性能和免疫性能的效果不僅要考慮使用劑量、飼喂方式，還要考慮家禽的日齡。