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        響應(yīng)面法優(yōu)化黑水虻抗菌肽提取工藝研究

        2023-02-06 05:58:00胡文舉孫英菲
        中國(guó)飼料 2023年2期
        關(guān)鍵詞:優(yōu)化影響模型

        胡文舉,孫英菲

        (河南開(kāi)放大學(xué),河南鄭州 450046)

        抗菌肽具有熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞幾乎無(wú)害等特點(diǎn)。杜紅等(2022)研究表明,將抗菌肽添加到飼料中能提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、免疫功能、血清抗氧化功能和促進(jìn)腸道發(fā)育(張書(shū)會(huì)等,2022;李美茹等,2020)。黑水虻又稱亮斑扁角水虻,是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的可飼用昆蟲(chóng)之一(Van,2013)。自然環(huán)境下黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)可產(chǎn)生抗菌肽來(lái)抵抗病原微生物。夏嬙等(2013)對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)進(jìn)行食源性人工誘導(dǎo),使其產(chǎn)生具有抑菌活性的抗菌肽成分。目前,黑水虻抗菌肽的制備途徑主要包括直接從幼蟲(chóng)體內(nèi)分離、化學(xué)合成和生物工程制備(Müller等,2014)。由于成本低、耗時(shí)短、工藝簡(jiǎn)單、抗菌效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),直接分離法成為目前黑水虻抗菌肽制備的常用方法。本研究采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)黑水虻抗菌肽提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期為黑水虻抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑 黑水虻蟲(chóng)卵購(gòu)自河南某黑水虻繁育基地;金黃色葡萄球菌菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

        EDTA-2Na、NaCl、蛋白胨、瓊脂粉、固體硫酸銨、去離子水、酵母提取物、無(wú)水乙醚等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;透析袋購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;超濾管購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

        LB 培養(yǎng)基 :10 g蛋白胨,5 g酵母提取物,5 g NaCl,15 g 瓊脂,1000 mL 蒸餾水。

        1.2 主要儀器設(shè)備 DHG-3000AE型電熱烘干箱:無(wú)錫展霖環(huán)境科技有限公司;BILON-DFT-100A型粉碎機(jī):上海比朗儀器制造有限公司;JIDI-16D離心機(jī):廣州吉迪儀器有限公司;BXP-65型生物培養(yǎng)箱:上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;MKZ-G2A真空冷凍干燥箱:青島邁可威微波創(chuàng)新科技有限公司;超低溫冰箱MD-86L58:美的集團(tuán)股份有限公司;BBS-H1800超凈工作臺(tái):濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 黑水虻的飼養(yǎng)與誘導(dǎo) 將孵化72 h后的黑水虻幼蟲(chóng)置于飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng)至5齡期,在飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)加入5 mL含有金黃色葡萄球菌(3×1012個(gè)/mL)的菌液繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。

        1.3.2 樣品預(yù)處理 取適量的黑水虻幼蟲(chóng),用純凈水沖洗干凈,吸干水分,50℃烘干至恒重,研磨粉碎,索氏提取法脫脂,破壁機(jī)粉碎過(guò)70目篩后冷凍保存。

        1.3.3 黑水虻抗菌肽的提取 稱取10 g脫脂黑水虻幼蟲(chóng)粉,加入含0.9% NaCl的EDTA緩沖液,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行浸提。浸提后8層紗布過(guò)濾,8000 r/min 離心 15 min,取上清液加入硫酸銨(質(zhì)量百分比濃度70%),攪拌至充分溶解,4℃靜止4 h,10000 r/min 離心 15 min,棄上清液。參照張弘弛等(2021年)的方法,將黑水虻幼蟲(chóng)粗蛋白提取物用1 kD透析袋4℃下透析24 h,期間換液3次。將透析后的粗蛋白加入到10 kD超濾管內(nèi),5000 r/min 離心 1 h,收集管底液,真空冷凍干燥稱重后保存。

        1.3.4 抗菌肽提取率的測(cè)定 抗菌肽提取率=抗菌肽的質(zhì)量/黑水虻蟲(chóng)干的質(zhì)量

        1.3.5 抗菌肽抗菌活性的檢測(cè) 以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用牛津杯擴(kuò)散法測(cè)定黑水虻抗菌肽的抑菌活性(李美茹等,2010)。試驗(yàn)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照,其中,陰性對(duì)照為滅菌蒸餾水,陽(yáng)性對(duì)照為4 U/mL青霉素。將LB平板置于37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈的直徑,每組試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值。

        1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        1.4.1 單因素試驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)(韓玉竹等,2019),在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上分別研究液料比(2∶1、4∶ 1、6∶ 1、8∶ 1、10 ∶ 1 g/mL)、浸提時(shí)間(4、8、12、16、20 h)、超聲功率(10、30、50、70、90 W)對(duì)黑水虻抗菌肽提取率和抗菌活性的影響。

        1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以液料比、浸提時(shí)間和超聲功率為自變量,以提取率為響應(yīng)值,利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),利用Design-Expert 10.07軟件進(jìn)行分析。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 液料比對(duì)抗菌肽的影響 由圖1可知,黑水虻抗菌肽的提取率隨液料比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為6∶1時(shí),提取率達(dá)到最高值1.03%,但與4∶1和8∶1組差異不顯著(P>0.05),當(dāng)液料比達(dá)到10∶1時(shí)抗菌肽提取率最低,為0.64%,與4∶1、6∶1和8∶1組差異極顯著(P<0.01),與2∶1組差異不顯著(P>0.05)。從抑菌效果看,2∶1組抑菌圈直徑最小,為11.32 mm,與其他組相比差異極顯著(P<0.01)。因此,在響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)時(shí)選擇液料比6∶1作為中心試驗(yàn)點(diǎn)。

        圖1 液料比對(duì)黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影響

        2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)抗菌肽的影響 由圖2可知,黑水虻抗菌肽提取率隨浸提時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì),浸提時(shí)間為4 h時(shí),抗菌肽提取率最低,為0.71%,與其他組差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)抗菌肽提取率最高,為1.26%,但與 8、16、20 h 組差異不顯著(P > 0.05)。浸提時(shí)間對(duì)黑水虻抗菌肽的抑菌效果影響各組之間差異不顯著(P>0.05)。因此,確定黑水虻抗菌肽最佳浸提時(shí)間為12 h,并將浸提12 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

        圖2 浸提時(shí)間對(duì)黑水虻抗菌肽的提取率及抗菌性能的影響

        2.1.3 超聲功率對(duì)抗菌肽的影響 由圖3可知,超聲功率為30 W時(shí),黑水虻抗菌肽提取率比10 W時(shí)顯著提高,當(dāng)超聲波功率達(dá)到50 W時(shí)黑水虻抗菌肽的提取率最高,達(dá)到1.14%。隨功率的提高,提取率有下降趨勢(shì)。當(dāng)超聲波功率大于70 W時(shí),提取的抗菌肽抑菌效果呈顯著下降趨勢(shì),抑菌圈直徑顯著低于10、30和50 W組。綜合考慮提取率和抑菌效果,最佳超聲功率選定為50 W,每10 W一個(gè)梯度。

        圖3 超聲功率對(duì)黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影響

        2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所得數(shù)據(jù),經(jīng)回歸擬合得到二次多項(xiàng)回歸方程為:

        Y=1.4678-0.1011A+0.0279B+0.0193C+0.01 4AB+0.0653AC-0.0243BC-0.2742A2-0.1871B2-0.1829C2

        回歸模型方差分析見(jiàn)表2。由表2可知,該模型P<0.01,模型整體達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)P>0.05,失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明該模型擬合較好,能準(zhǔn)確反應(yīng)液料比、浸提時(shí)間和超聲功率對(duì)抗菌肽提取率的影響。模型決定系數(shù)R2=0.9641,說(shuō)明不到5%的變異無(wú)法利用該模型進(jìn)行解釋。矯正決定系數(shù),擬合決定系數(shù),說(shuō)明該模型可靠,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間誤差較小,能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析黑水虻抗菌肽最佳提取工藝參數(shù)和結(jié)果?;貧w模型中一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)黑水虻抗菌肽提取效率影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。各因素對(duì)黑水虻抗菌肽提取率影響順序?yàn)锳>B>C。

        表2 回歸模型分析結(jié)果

        2.3 響應(yīng)面交互作用分析 利用Design-Expert 10.07軟件繪制3個(gè)因素交互作用對(duì)黑水虻抗菌肽提取率影響的響應(yīng)面圖(見(jiàn)圖4)。由圖4可知,液料比和超聲功率的交互作用對(duì)抗菌肽提取率影響最為顯著,浸提時(shí)間分別與液料比和超聲功率的交互作用均不明顯。

        圖4 液料比、浸提時(shí)間、超聲功率對(duì)提取率交互作用的響應(yīng)面圖

        2.4 最佳提取工藝的確認(rèn)與驗(yàn)證 根據(jù)模型分析結(jié)果,黑水虻抗菌肽最佳提取條件為液料比6.964、浸提時(shí)間 12.335 h、超聲功率 51.338 W,此時(shí)黑水虻抗菌肽的提取率預(yù)測(cè)值為1.360%。為便于驗(yàn)證試驗(yàn)的進(jìn)行,將提取條件修正為液料比7.0,浸提時(shí)間 12 h,超聲功率 50 W。按照修正條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得該條件下黑水虻抗菌肽的提取率為1.34%,與預(yù)測(cè)值非常接近,說(shuō)明該模型準(zhǔn)確可行,所確定的提取條件可靠。此外,3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)所提取的抗菌肽抑菌圈直徑為(12.68±0.72)mm,與各單因素試驗(yàn)最高值相比差異不顯著(P>0.05),表明最佳提取條件下提取的抗菌肽抑菌效果穩(wěn)定。

        3 討論

        隨著抗菌肽功能研究的不斷深入,抗菌肽的提取也越來(lái)越受關(guān)注??咕牡奶崛∈芴崛囟龋崛∫悍N類、比例,提取時(shí)間,輔助手段等多種因素的影響,并且各因素之間還存在互作效應(yīng)。本研究采用響應(yīng)面設(shè)計(jì),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)液料比、浸提時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素之間的互作效應(yīng)進(jìn)行研究,以探索黑水虻抗菌肽的最佳提取工藝。在單因素試驗(yàn)中,料液比對(duì)黑水虻抗菌肽提取率的影響趨勢(shì)與李美茹等(2020)在紅線蟲(chóng)上的研究類似,可能是因?yàn)橐毫媳冗^(guò)低時(shí),蟲(chóng)體內(nèi)抗菌效果較強(qiáng)的多肽不能充分溶解,隨著提液料比的增大,蟲(chóng)體內(nèi)的抗菌肽被充分溶解在提取液內(nèi),但當(dāng)液料比過(guò)高,抗菌肽凝析不完全,反而影響了提取效果。隨著浸提時(shí)間的增加,黑水虻抗菌肽提取率呈先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì),可能是因?yàn)榻?2 h左右,黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的抗菌肽已經(jīng)達(dá)到靜態(tài)下所能提取的極值。在浸提過(guò)程中,隨著超聲波功率的提高,抗菌肽提取率先呈現(xiàn)上升趨勢(shì),當(dāng)功率達(dá)到50 W后提取率達(dá)到最高值,隨后隨著功率的繼續(xù)增大,提取率和抗菌效果均呈顯著下降趨勢(shì),這主要是因?yàn)樘崛∵^(guò)程中輔以超聲波能加快提取液的振動(dòng)頻率,促進(jìn)提取液進(jìn)入黑水虻組織,有利于抗菌肽的提取,超聲功率過(guò)大則會(huì)破壞抗菌肽的結(jié)構(gòu),從而影響提取效果和抑菌效果(許依能等,2022)。利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)3個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,建立最優(yōu)提取條件的二次多項(xiàng)回歸模型,通過(guò)對(duì)模型的分析可知,液料比和超聲功率的交互作用對(duì)抗菌肽提取率影響最為顯著,其余交互作用均不顯著,模型預(yù)測(cè)的最佳提取條件為液料比6.964、浸提時(shí)間12.335 h、超聲功率51.338 W,提取率預(yù)測(cè)值為1.360%,對(duì)提取條件進(jìn)行修正和驗(yàn)證得知,抗菌肽提取率可以達(dá)到1.34%,與預(yù)測(cè)值基本契合,提取率比優(yōu)化前提高了6.35%。

        4 結(jié)論

        本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)黑水虻抗菌肽的提取條件采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,黑水虻抗菌肽的最優(yōu)提取條件為液料比7 ∶ 1,浸提時(shí)間 12 h,超聲波功率 50 W,在此條件下,提取的抗菌肽提取率為1.34%,抗菌肽抑菌圈直徑為(12.68±0.72)mm。說(shuō)明該條件下提取的黑水虻抗菌肽提取率高,抑菌效果恒定,可為今后黑水虻產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

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