黃永鵬,唐 慧,孟祥燕,鐘 輝,宋云揚(yáng),陳 博,鄒志云(國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102205)

環(huán)孢素A和西羅莫司(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)作為免疫抑制劑,已成功應(yīng)用于許多器官移植手術(shù)[1-3]。這兩種免疫抑制劑的治療窗口非常窄,僅在特定的血藥濃度范圍內(nèi)有預(yù)期的治療效果,當(dāng)血藥濃度較低時(shí),存在器官排斥的風(fēng)險(xiǎn),而血藥濃度較高時(shí),可能會(huì)出現(xiàn)腎臟毒性、心臟毒性、神經(jīng)毒性等嚴(yán)重的副作用[4]。另一方面,這兩種免疫抑制劑一起使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),臨床上通常將其聯(lián)合使用[5]。免疫抑制劑的治療范圍受移植器官、患者年齡等多種因素影響。據(jù)報(bào)道,環(huán)孢素A的治療范圍為50～300 ng/mL[6],西羅莫司的治療范圍為12～30 ng/mL,當(dāng)與環(huán)孢素A聯(lián)合使用時(shí),其治療范圍為4～12 ng/mL[5]。因此,對(duì)這兩種免疫抑制劑同時(shí)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè),在器官移植后的給藥方案中發(fā)揮著重要作用。

文獻(xiàn)報(bào)道的用于定量分析環(huán)孢素A、西羅莫司、他克莫司等免疫抑制劑的方法主要包括免疫分析法[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[9-12]。免疫分析法操作簡單,但抗體可能會(huì)與免疫抑制劑代謝的非活性產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng),從而高估藥物水平[13]。HPLC也常用于對(duì)全血中單個(gè)或多個(gè)免疫抑制劑的定量分析,通常需要較長的色譜運(yùn)行時(shí)間,以分離多個(gè)目標(biāo)物和減小基質(zhì)干擾[14];最近報(bào)道了一種基于智能化學(xué)計(jì)量學(xué)的高效液相色譜法,該法通過對(duì)紫外光譜進(jìn)行處理,實(shí)現(xiàn)了快速定量分析全血中3種免疫抑制劑[15]。HPLC-MS/MS以獨(dú)特的選擇性和靈敏度,主要用于檢測(cè)動(dòng)物內(nèi)臟、血液、尿液等生物樣品中免疫抑制劑的含量,但該方法也受到基質(zhì)效應(yīng)、儀器成本高和需要專業(yè)人員操作等因素的限制[16]。

圖1 免疫抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of immunosuppressants

由于環(huán)孢素A的構(gòu)象異構(gòu)體在傳統(tǒng)反相C8或C18柱上具有一定的分離度(R),造成其具有明顯的色譜峰展寬效應(yīng)[17],為了達(dá)到更好的分離效果和更高的檢測(cè)靈敏度,氰基柱[18]或苯基-己基柱[10,19]成為分離和檢測(cè)這些免疫抑制劑更佳的選擇;此外,采用HPLC快速分離和檢測(cè)全血中環(huán)孢素A和西羅莫司含量的文獻(xiàn)也少有報(bào)道。隨著色譜柱技術(shù)的發(fā)展,針對(duì)蛋白質(zhì)、多肽等大分子的生物液相色譜柱不斷研發(fā)出來,本研究考察了環(huán)孢素A和西羅莫司在生物液相色譜柱和傳統(tǒng)液相色譜柱上的色譜行為,并基于生物液相色譜柱建立了可快速分離和檢測(cè)全血中環(huán)孢素A和西羅莫司的HPLC分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀,配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD);XP105天平(上海Mettler-Toledo公司)。

乙腈和甲醇(HPLC級(jí),德國Merck公司);甲酸、三氟乙酸、乙醚和氫氧化鈉(分析純,上海Macklin Biochemical公司);環(huán)孢素A和西羅莫司(純度≥98%,南京都萊生物技術(shù)有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量的環(huán)孢素A和西羅莫司,用甲醇溶解并定容,分別配制成1 000 μg/mL和500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用甲醇稀釋得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用經(jīng)樣品前處理后的空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制備成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確量取50 μL全血樣品,加入100 μL氫氧化鈉水溶液(1 mol/L)并振蕩30 s,再加入500 μL乙醚-甲醇(95∶5,v/v)并振蕩30 s,然后以14 000 r/min離心10 min,取有機(jī)層溶液在50 ℃下用氮?dú)獯蹈?最后加入200 μL甲醇溶解,待用。

1.4 液相色譜條件

色譜柱:ZORBAX 300 SB C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm,美國Agilent公司);柱溫60 ℃;流動(dòng)相:乙腈-水(70∶30,v/v);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長:205 nm(環(huán)孢素A)和278 nm(西羅莫司);進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件對(duì)免疫抑制劑色譜行為的影響

實(shí)驗(yàn)中,保持環(huán)孢素A和西羅莫司溶液濃度一致,在流速為1 mL/min、進(jìn)樣量為20 μL和檢測(cè)波長分別為205 nm和278 nm的條件下,分別考察了色譜柱、流動(dòng)相組成、流動(dòng)相添加劑和柱溫對(duì)兩種免疫抑制劑色譜行為的影響。

2.1.1色譜柱

在流動(dòng)相為乙腈-水(80∶20,v/v)、柱溫為50 ℃的條件下,考察了環(huán)孢素A和西羅莫司在6種Agilent反相色譜柱(色譜柱基本信息見表1)上的色譜保留行為,色譜圖和半峰寬值見圖2。結(jié)果表明,環(huán)孢素A和西羅莫司在不同色譜柱上的色譜保留行為差異顯著,尤其環(huán)孢素A在不同色譜柱上的色譜峰展寬效應(yīng)明顯不同;與傳統(tǒng)液相色譜柱相比,兩種免疫抑制劑均在ZORBAX 300SB C8生物液相色譜柱上具有最高的色譜峰和最小的半峰寬,尤其環(huán)孢素A在該柱的色譜峰高和半峰寬分別是其他5種色譜柱的2.5～7.5倍和0.13～0.39倍?？梢钥闯?采用生物液相色譜柱對(duì)環(huán)孢素A和西羅莫司進(jìn)行分析,可顯著提高檢測(cè)靈敏度。這可能與色譜柱的孔徑有關(guān),ZORBAX 300SB C8柱的孔徑最大,其次為InfinityLab Poroshell 120 EC C8柱,最小的為ZORBAX Eclipse XDB C18柱,兩種免疫抑制劑的色譜峰高和半峰寬的變化趨勢(shì)也基本與色譜柱的孔徑變化分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。

表1 使用的色譜柱基本信息Table 1 Basic information of the employed chromatography columns

圖3 環(huán)孢素A和西羅莫司在乙腈-水流動(dòng)相體系中的色譜峰參數(shù)Fig.3 Chromatographic peak parameters of cyclosporine A and sirolimus in ACN-water mobile phases

2.1.2流動(dòng)相組成

在50 ℃柱溫下,考察了乙腈-水流動(dòng)相體系對(duì)環(huán)孢素A和西羅莫司在3種色譜柱上色譜行為的影響,流動(dòng)相組成與保留因子(k)和理論塔板數(shù)(N)的關(guān)系見圖3。結(jié)果表明,在3種色譜柱上,環(huán)孢素A和西羅莫司的保留時(shí)間(tR)均隨著流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的減小呈指數(shù)增大的趨勢(shì);當(dāng)流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí),環(huán)孢素A和西羅莫司在ZORBAX 300SB C8柱上的理論塔板數(shù)均隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大而顯著增大,且顯著高于在其他兩種色譜柱上的理論塔板數(shù)。

2.1.3流動(dòng)相添加劑

在50 ℃柱溫條件下,通過在流動(dòng)相中添加三氟乙酸和甲酸兩種離子對(duì)試劑,考察了其對(duì)環(huán)孢素A和西羅莫司保留時(shí)間的影響,結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,在3種色譜柱上,兩種流動(dòng)相添加劑對(duì)環(huán)孢素A和西羅莫司的保留時(shí)間幾乎沒有影響。這是由于環(huán)孢素A和西羅莫司化學(xué)結(jié)構(gòu)中均沒有游離的氨基和羧基,故酸性離子對(duì)試劑對(duì)其色譜保留行為沒有顯著影響。

圖4 環(huán)孢素A和西羅莫司在不同流動(dòng)相中的保留時(shí)間Fig.4 Retention of cyclosporine A and sirolimus in different mobile phases

圖5 環(huán)孢素A和西羅莫司在不同色譜柱上的保留因子與柱溫的關(guān)系圖Fig.5 Relationships between retention factor and column temperature of cyclosporine A and sirolimus on different chromatography columns

圖6 環(huán)孢素A和西羅莫司在不同色譜柱上的柱溫與柱效關(guān)系圖Fig.6 Relationships between the column temperature and chromatographic efficiency of cyclosporine A and sirolimus on different chromatography columns

2.1.4柱溫

在流動(dòng)相為乙腈-水(80∶20,v/v)的條件下,采用Van’t Hoff方程[20-22]考察了柱溫對(duì)環(huán)孢素A和西羅莫司色譜行為的影響,柱溫與保留因子k和理論塔板數(shù)N的關(guān)系見圖5和圖6。結(jié)果表明,隨著柱溫的升高,在3種色譜柱上,環(huán)孢素A和西羅莫司的保留因子基本呈減小趨勢(shì);在實(shí)驗(yàn)柱溫范圍內(nèi),西羅莫司在3種色譜柱上的lnk和柱溫的倒數(shù)(1/T)線性關(guān)系均較好(r>0.96),環(huán)孢素A在ZORBAX Eclipse Plus C18和ZORBAX Eclipse Plus C8柱上相應(yīng)的線性關(guān)系較好(r>0.99);當(dāng)柱溫在45～70 ℃ (1/T:3.14×10-3～2.91×10-3K-1)之間時(shí),環(huán)孢素A在ZORBAX 300SB C8柱上相應(yīng)的線性關(guān)系較好(r>0.99),而柱溫在25～40 ℃ (1/T:3.35×10-3～3.19 ×10-3K-1)之間時(shí),其線性關(guān)系較差,且柱溫為25 ℃(1/T:3.35×10-3K-1)時(shí)色譜峰發(fā)生裂分現(xiàn)象;在實(shí)驗(yàn)柱溫范圍內(nèi),環(huán)孢素A和西羅莫司在ZORBAX Eclipse Plus C18和ZORBAX Eclipse Plus C8柱的理論塔板數(shù)相近,而在其ZORBAX 300SB C8柱的理論塔板數(shù)均顯著高于其他兩柱。有理論[17]認(rèn)為,升高柱溫可以減小免疫抑制劑的構(gòu)象分離和色譜峰寬,從而提高柱效,并且升高柱溫可減小流動(dòng)相的黏度,有利于減小流動(dòng)相傳質(zhì)阻力,可進(jìn)一步提高柱效;此外,ZORBAX 300SB C8柱具有更大的孔徑,固定相傳質(zhì)阻力也更小,柱效也更高。因此,在較高的柱溫條件下,環(huán)孢素A和西羅莫司在ZORBAX 300SB C8柱上的柱效和檢測(cè)靈敏度會(huì)顯著優(yōu)于其他兩柱。

圖7 環(huán)孢素A和西羅莫司在不同色譜條件下的分離度Fig.7 Resolutions of cyclosporine A and sirolimus under different chromatography conditions

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

生物液相色譜柱和傳統(tǒng)液相色譜柱對(duì)兩種免疫抑制劑色譜行為的影響結(jié)果表明,生物液相色譜柱在檢測(cè)環(huán)孢素A和西羅莫司時(shí)具有顯著的優(yōu)勢(shì),因此,在ZORBAX 300SB C8柱上對(duì)兩種免疫抑制劑分離的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,不同色譜條件下的分離度結(jié)果見圖7。結(jié)果表明,分離度隨流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的減小而增大,當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)小于80%時(shí),環(huán)孢素A和西羅莫司的色譜峰可完全分離(R≥ 1.5);分離度隨柱溫的升高而增大,當(dāng)柱溫高于50 ℃時(shí),環(huán)孢素A和西羅莫司的色譜峰可完全分離。因此,減小流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)或/和升高柱溫可實(shí)現(xiàn)兩種免疫抑制劑的完全分離。

由于全血樣品中含有大量的蛋白質(zhì)和多肽,即使經(jīng)過前處理仍可能會(huì)對(duì)這兩種免疫抑制劑的檢測(cè)產(chǎn)生干擾,因此,進(jìn)一步考察了空白全血的基質(zhì)效應(yīng),采用1.4節(jié)的液相色譜條件,對(duì)經(jīng)1.3節(jié)前處理后的空白全血和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液進(jìn)行檢測(cè),色譜圖見圖8。結(jié)果表明,經(jīng)前處理后的空白全血中,仍有內(nèi)源性物質(zhì)C1和C2可能會(huì)對(duì)這兩種免疫抑制劑的檢測(cè)產(chǎn)生干擾;當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水(70∶30,v/v)、柱溫為60 ℃時(shí),C1和C2對(duì)環(huán)孢素A的干擾較小,對(duì)西羅莫司的干擾幾乎沒有,且環(huán)孢素A與西羅莫司可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離(R=3.7,205 nm)。因此,兼顧兩種免疫制劑的分離度、檢測(cè)靈敏度和全血樣品的基質(zhì)效應(yīng),本文建立的快速分離和檢測(cè)全血中兩種免疫抑制劑的高效液相色譜分析條件具體見1.4節(jié)。

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用1.4節(jié)的液相色譜條件對(duì)1.2節(jié)配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定,以分析物的峰面積(Y)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X,ng/mL)進(jìn)行線性回歸,得到環(huán)孢素A和西羅莫司的線性方程和相關(guān)系數(shù),以S/N≥ 3和10的濃度為方法的檢出限和定量限,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,環(huán)孢素A和西羅莫司在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997,檢出限分別為10 ng/mL和1 ng/mL,定量限分別為30 ng/mL和2 ng/mL。

圖8 空白全血及環(huán)孢素A和西羅莫司混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的色譜圖Fig.8 Chromatograms of a blank sample of whole blood and a mixed standard solution of cyclosporine A and sirolimus

2.4 精密度、準(zhǔn)確度和加標(biāo)回收率

在空白全血中,分別添加3個(gè)水平的環(huán)孢素A和西羅莫司溶液,進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度和加標(biāo)回收率試驗(yàn),加標(biāo)樣品按照1.3節(jié)方法處理后進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,環(huán)孢素A和西羅莫司的平均回收率分別為83.5%～89.7%和95.8%～97.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%～9.0%和3.4%～6.7%。該方法能夠較好地滿足全血樣品中兩種免疫抑制劑含量的測(cè)定要求。

3 結(jié)論

本研究考察了環(huán)孢素A和西羅莫司在生物液相色譜柱和傳統(tǒng)液相色譜柱上的色譜行為,并基于生物液相色譜柱建立了快速同時(shí)測(cè)定全血中這兩種免疫抑制劑含量的高效液相色譜分析方法,該方法具有流動(dòng)相簡單、分析時(shí)間短、線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可為全血中環(huán)孢素A和西羅莫司含量的檢測(cè)提供技術(shù)支持。