李澤華,王 闖,2,徐 斌,陳 佳,張 瑛,郭 磊*,謝劍煒(.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 00850;2.中央民族大學(xué)藥學(xué)院,民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0008;.北京市公安司法鑒定中心,法庭毒物分析公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0092)

世界范圍內(nèi),疑似蛇毒中毒事件經(jīng)常發(fā)生,其中蛇毒確證鑒定、種屬來(lái)源剖析成為該類事件判定的關(guān)鍵。每年多達(dá)270萬(wàn)人因毒蛇咬傷中毒,其中8.1～13.8萬(wàn)人因蛇咬傷致死[1,2]。世界上已發(fā)現(xiàn)蛇類3 000余種,其中毒蛇約有650種,對(duì)人體有致命威脅的毒蛇300種。我國(guó)有蛇類210種,隸屬9科53屬,其中毒蛇有100多種[3],但劇毒蛇類僅10余種,主要為眼鏡蛇、蝮蛇、竹葉青蛇、銀環(huán)蛇等[4]。蛇毒是毒蛇從毒腺中分泌出來(lái)的復(fù)雜混合物,含有蛋白質(zhì)、多肽、脂類、核苷、糖類、氨基酸、胺類、金屬離子等,主要成分則為蛋白質(zhì)和多肽[5];按毒理學(xué)分類可分為神經(jīng)毒素、抗凝及促凝血毒素、心臟毒素等各種毒素蛋白以及酶。蛋白質(zhì)和肽是蛇毒發(fā)揮毒性和藥性作用的關(guān)鍵組分。美國(guó)食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)已批準(zhǔn)源自蛇毒的抗血栓藥鹽酸替羅非班注射液和降壓藥卡托普利上市[6]。目前蛇毒在抗腫瘤、抗菌、抗病毒方面的作用也逐漸引起人們的重視。近日Freire等研究發(fā)現(xiàn)巴西矛頭蝮蛇毒的衍生物可以抑制非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)中新冠病毒的復(fù)制,抑制率可達(dá)75%[7]?？焖佟?zhǔn)確的蛇毒蛋白質(zhì)分析鑒定方法的建立,對(duì)蛇毒中毒司法鑒定、中毒救治以及蛇毒藥物的研發(fā)具有重要意義。

針對(duì)蛇毒鑒定,其經(jīng)典分析方法主要為針對(duì)DNA或蛋白質(zhì)的生化或免疫測(cè)定,例如聚合酶鏈反應(yīng)、凝集測(cè)試、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)、生物傳感等[8]。但均存在假陽(yáng)性率高、靈敏度低、抗干擾能力差、種屬區(qū)分度有限等局限性。近年來(lái),隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,蛇毒毒液蛋白質(zhì)組學(xué)研究亦受到重視[9]。目前,蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究步驟分為粗毒分離、質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)鑒定3個(gè)部分。粗毒分離的方法包括二維電泳、尺寸排阻色譜(SEC)及高效液相色譜等;質(zhì)譜分析方法包括基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、電噴霧-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等[10];而基于MS-Fit或Mascot搜索引擎訪問(wèn)相應(yīng)的蛋白質(zhì)網(wǎng)站,對(duì)所獲取質(zhì)譜肽段序列查詢比對(duì),則是生物信息學(xué)鑒定的主要手段。迄今,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)對(duì)游蛇科、眼鏡蛇科、蝰科中的58個(gè)屬100多種(亞種)蛇毒進(jìn)行了研究,鑒定出了10多個(gè)蛋白質(zhì)家族[11]。根據(jù)數(shù)據(jù)采集方式,可將蛋白質(zhì)組學(xué)分為非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)兩類。前者信息最為豐富,而后者具有更高的特異性和靈敏度。

目前法醫(yī)物證鑒定時(shí)基于蛋白質(zhì)組學(xué)的種屬鑒定尚處于起步階段。主要原因如下：一方面,蛋白質(zhì)組學(xué)的分析鑒定本質(zhì)是基于質(zhì)譜斷裂規(guī)律和理論計(jì)算的合理推測(cè),但多肽序列的二級(jí)質(zhì)譜譜圖具有高度復(fù)雜性,法醫(yī)蛋白質(zhì)組學(xué)中基于MS/MS鑒定肽段時(shí)主要使用非靶向采集后數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的途徑,具有一定的錯(cuò)誤率。中毒樣品還可能存在中毒機(jī)體自身種屬蛋白質(zhì)的極大干擾;另一方面,針對(duì)未知物質(zhì)的確證鑒定,通常采用與標(biāo)準(zhǔn)品(參考品)進(jìn)行比較的方式[12,13],但目前蛇毒的參考品仍缺乏。

本研究采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù),基于納升級(jí)超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Nano LC-MS/HRMS)系統(tǒng),針對(duì)5個(gè)疑似蛇毒樣品,經(jīng)胰蛋白酶溶液內(nèi)酶解后,首先以非靶向模式采集數(shù)據(jù)后進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得未知樣品中蛋白質(zhì)的物種來(lái)源信息;然后通過(guò)控制肽譜匹配度(PSM)、肽段錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)值和特征肽段的數(shù)量來(lái)提高蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確度;再采用靶向采集模式對(duì)推斷的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證,最終成功鑒定出5個(gè)疑似蛇毒樣品均含有來(lái)源于中華眼鏡蛇(Najaatra)的蛇毒。該分析策略簡(jiǎn)便、嚴(yán)格、可靠性強(qiáng),可為蛇毒中毒的司法案件鑒定、臨床中毒救治以及蛇毒藥物研發(fā)提供有效的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑、材料

EASY-nLC 1200納升液相色譜、Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,AKTA Pure 25色譜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司,十萬(wàn)分之一天平R200 D購(gòu)自德國(guó)Sartorious公司。ProteaseMAX表面活性劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司,胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))、乙腈(色譜純)、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(包含抑肽酶6.5 kDa、核糖核酸酶A 13.7 kDa、碳酸酐酶29 kDa、卵清蛋白43 kDa、伴清蛋白75 kDa 5種蛋白質(zhì))購(gòu)自美國(guó)Citiva公司,三氟乙酸、甲酸(分析純)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司,碳酸氫銨(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q A10型超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。5個(gè)疑似蛇毒樣品均為同一種蛇毒液污染樣品,來(lái)自北京市公安局司法鑒定中心(見(jiàn)表1)。

表1 疑似蛇毒樣品的性狀Table 1 Characters of suspected snake venom samples

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1Nano LC-MS/HRMS條件

脫鹽富集柱:Thermo Acclaim PepMapTM100柱(2 cm×75 μm,3 μm);分離柱:Thermo Acclaim PepMapTMRSLC納升分析柱(25 cm×75 μm,2 μm)。流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液-乙腈(1∶4,v/v);洗脫程序:0～5 min,4%B～10%B;5～63 min,10%B～30%B;63～72 min,30%B～40%B;72～80 min,40%B～100%B。流速為300 nL/min;進(jìn)樣量為1 μL。

離子源溫度:320 ℃;毛細(xì)管電壓:3.6 kV;輔助氣溫度:320 ℃;鞘氣流速:10 L/h;輔助氣流速:30 L/h;采集模式:全掃描-數(shù)據(jù)依賴型MS/MS(Full MS/dd MS2)和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM);碰撞能量(CE):15、27.5、40 eV;采集范圍:200～2 200 Da;電離模式:ESI正離子模式;一級(jí)質(zhì)譜分辨率為35 000 FWHM,二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17 500 FWHM。

1.2.2Proteome Discover參數(shù)設(shè)置

搜索引擎:SequestHT;數(shù)據(jù)庫(kù):Swiss-Prot全庫(kù)、蛇亞目(Serpentes)、游蛇科(Colubroidea)、眼鏡蛇科(Elapidae)、眼鏡蛇亞科(Elapinae)、眼鏡蛇屬(Naja)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù);胰蛋白酶(全切);最小肽段長(zhǎng)度:6個(gè)氨基酸;最大肽段長(zhǎng)度:144個(gè)氨基酸;最大漏切位點(diǎn):2;碎片離子的質(zhì)量誤差:0.02 Da;肽段的質(zhì)量誤差:5×10-6(5 ppm);PSM和肽段置信度均為High,肽段的FDR設(shè)為小于0.01。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1樣品前處理

5個(gè)樣品,每個(gè)約含0.8～1 mg蛋白質(zhì),分別加入2 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),振搖1 min后14 000 g離心取上清液凍干備用。

1.3.2尺寸排阻色譜

采用Superdex 200 increase 10/300 GL預(yù)裝柱(Cytiva公司)進(jìn)行分子尺寸排阻色譜分離。對(duì)預(yù)裝柱進(jìn)行平衡后,利用10 mmol/L PBS以0.5 mL/min的流速對(duì)5個(gè)樣品凍干粉的PBS溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫得到的各個(gè)組分,凍干備用,蛋白質(zhì)含量由280 nm處的峰高度估算得到(50 mAU=0.2 mg)。

1.3.3溶液胰蛋白酶酶切

取約100 μg樣品,加入2 μL 1% ProteaseMAX表面活性劑后,加入250 mmol/L 碳酸氫銨使其終濃度為50 mmol/L。加入1 μL 0.5 mol/L二硫蘇糖醇56 ℃孵育20 min,冷卻至室溫后加入2.7 μL 0.55 mol/L碘乙酰胺,室溫避光孵育15 min。向上述孵育體系中加入1 μL 1% ProteaseMAX表面活性劑和1.8 μL胰蛋白酶(樣品與胰蛋白酶的質(zhì)量比為1∶50),于37 ℃孵育3 h。加入三氟甲酸至終濃度為0.1%(v/v),室溫孵育5 min后終止反應(yīng)。加入4倍體積的甲醇-乙腈(1∶3,v/v)混合液渦旋1 min后,14 000 g離心取上清液濃縮至干,以0.1%甲酸水溶液復(fù)溶至50 μL。

1.3.4Nano LC-MS/HRMS分析鑒定

樣品經(jīng)溶液內(nèi)酶解處理后,在Nano LC-MS/HRMS的Full MS/dd MS2模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。將采集的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入Proteome Discover軟件(ver.2.5),利用SequestHT搜索引擎在Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋匹配相關(guān)蛋白質(zhì),給出的信息包括匹配的蛋白質(zhì)和肽段、肽段覆蓋率、SequestHT評(píng)分以及與數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配的y+、b+離子等信息[14]。

圖1 5個(gè)樣品以10 mmol/L PBS洗脫的SEC色譜圖Fig.1 Size exclusion chromatograms (SEC) of the five samples eluted by 10 mmol/L phosphate-buffered saline

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析前的分離分析

進(jìn)行質(zhì)譜分析前,對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x純化是一種獲取高蛋白質(zhì)組覆蓋范圍、提高蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的有效方式[15]。蛇毒的組成豐富、多樣,且由于新鮮的蛇毒含有65%～80%的水分,新鮮蛇毒樣品并不十分穩(wěn)定,多數(shù)新鮮蛇毒室溫下容易發(fā)生降解變質(zhì)[6]。在目前常見(jiàn)的蛇毒分離途徑[8]中,SEC簡(jiǎn)捷、快速、載樣量高,一般在低溫下進(jìn)行分離,有利于保持樣品的穩(wěn)定性[16]。我們即采用SEC對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行了分離。如圖1所示,樣品均可分離得到3個(gè)譜峰且對(duì)應(yīng)的洗脫體積基本一致。與低相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)比較,5個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量范圍均小于43 kDa,多數(shù)蛋白質(zhì)分布于6.5～29 kDa范圍內(nèi),少量蛋白質(zhì)小于6.5 kDa,這與蛇毒中大量的蛋白質(zhì)為低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)這一特征相符合[17]。

近年來(lái)Nano LC在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域成為主要的分離手段,其流速為幾十到幾百nL/min,色譜柱單位截面積的進(jìn)樣濃度大于常規(guī)色譜柱,樣品的稀釋效應(yīng)低,展現(xiàn)出更高的靈敏度[18]。因此,本研究采用Nano LC代替了UPLC用于質(zhì)譜前酶解肽段的分離,針對(duì)樣品E,考察了60、90、120 min 3個(gè)梯度,與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后分別可匹配到82、87和83種蛋白質(zhì),我們?cè)诖诉x擇90 min這一梯度,為法醫(yī)蛋白質(zhì)組學(xué)中未知樣品的鑒定提供了更豐富的信息。

2.2 非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

法醫(yī)蛋白質(zhì)組學(xué)中未知樣本的鑒定最具挑戰(zhàn)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配來(lái)識(shí)別多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定時(shí),數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇嚴(yán)重影響檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)量和種類。在生物醫(yī)學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的解決方案是將蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)相結(jié)合,基因組學(xué)可提供樣本匹配的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)用于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配[19,20]。但當(dāng)未聯(lián)合測(cè)定基因組時(shí),盡可能獲取豐富信息的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)就成為先決條件。

我們首先采用了Full MS/dd MS2非靶向數(shù)據(jù)采集模式,獲得樣品中肽段的精確相對(duì)分子質(zhì)量以及部分碎片信息,隨后將其導(dǎo)入Proteome Discover軟件,利用SequestHT搜索引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配。對(duì)于來(lái)自5個(gè)樣品的15個(gè)SEC組分,分別進(jìn)行多次蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配,每次根據(jù)上一次的搜庫(kù)結(jié)果不斷縮小數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模,以提高推斷未知樣品蛋白質(zhì)物種來(lái)源的準(zhǔn)確度。大型數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索匹配可提供樣本最豐富的信息,但過(guò)多與樣品不相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)會(huì)增加假陽(yáng)性率,而本研究中采用的“減小數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模將多肽分配到適當(dāng)?shù)姆诸惣?jí)別”這一途徑可解決這一問(wèn)題。

另外,從PSM、肽段置信度和特征肽段數(shù)目方面,進(jìn)一步提高未知樣品中蛋白質(zhì)物種來(lái)源的推斷準(zhǔn)確度。國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織[21]和國(guó)際禁止化學(xué)武器組織[22]提出的指南中,分別明確強(qiáng)調(diào)了人類蛋白質(zhì)和蓖麻毒素法醫(yī)檢測(cè)時(shí)特征肽段的重要性,且均規(guī)定至少需要兩條特征肽段來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。因此,參考上述指南,我們將PSM和肽段的FDR值控制在1%以下,特征肽段的數(shù)目≥2,符合目前蛋白質(zhì)鑒定中的較嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。

首先搜索匹配了經(jīng)驗(yàn)證和注釋的涵蓋所有物種蛋白質(zhì)的Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù),去除污染物庫(kù)后所有特征肽段數(shù)目≥2的蛋白質(zhì)其物種來(lái)源均為蛇,15個(gè)組分得到的蛋白質(zhì)總數(shù)為84。將數(shù)據(jù)再次提交至涵蓋所有與蛇相關(guān)蛋白質(zhì)的蛇亞目數(shù)據(jù)庫(kù),所有特征肽段數(shù)目≥2的蛋白質(zhì)其物種來(lái)源均為游蛇科,得到的蛋白質(zhì)總數(shù)為117。再次將數(shù)據(jù)提交至涵蓋所有游蛇科相關(guān)蛋白質(zhì)的游蛇科數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)所有特征肽段數(shù)目≥2的蛋白質(zhì)其物種來(lái)源均為眼鏡蛇科,得到的蛋白質(zhì)總數(shù)為114。

圖2 5個(gè)樣品的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配結(jié)果Fig.2 Results of protein database matching of the five samples The sections are named by the sample number-SEC eluted peak number;for example,A-p1 represents the first SEC eluted peak of sample A.

如圖2所示,搜索Elapidae數(shù)據(jù)庫(kù)可匹配到Acanthophiinae、Bungarinae、Elapinae、Laticaudinae、Notechinae 5個(gè)眼鏡蛇亞科的蛋白質(zhì)125種,其中Elapinae亞科的蛋白質(zhì)數(shù)量為107種,占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的85%以上。因此,我們將數(shù)據(jù)庫(kù)縮小至涵蓋所有眼鏡蛇亞科相關(guān)蛋白質(zhì)的Elapinae數(shù)據(jù)庫(kù),15個(gè)組分可匹配到Naja、Ophiophagus、Dendroaspispolylepis、Hemachatus、Walterinnesia、Micrurus6個(gè)屬的蛋白質(zhì)共113種,其中Naja屬的蛋白質(zhì)數(shù)量為100種,占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的88%以上。最后,將數(shù)據(jù)庫(kù)鎖定至涵蓋所有眼鏡蛇屬相關(guān)蛋白質(zhì)的Naja數(shù)據(jù)庫(kù),其中特征肽段數(shù)目≥2的蛋白質(zhì)其物種來(lái)源可歸屬至Najaatra、Najakaouthia、Najanaja、Najapallida、Najamossambica、Najasagittifera、Najasputatrix、Najamelanoleuca、Najaoxiana、Najaannulifera、Najahajehaje、Najasamarensis12個(gè)種,其中物種來(lái)源歸屬為Najaatra的蛋白質(zhì)數(shù)目最多,有32種。因此推斷樣品含有來(lái)自Najaatra的蛇毒。

從以上逐級(jí)收縮匹配到的蛋白質(zhì)數(shù)量可以看出,蛇物種數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的蛋白質(zhì)數(shù)量反而小于蛇亞目、游蛇科、蛇亞科等數(shù)據(jù)庫(kù),原因在于當(dāng)設(shè)定同樣的FDR閾值范圍(<1%)時(shí),數(shù)據(jù)庫(kù)越大,誘餌庫(kù)也越大,導(dǎo)致符合FDR閾值的PSM和肽段數(shù)目降低,鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目可能相應(yīng)減少。

圖3 3個(gè)SEC洗脫峰鑒定到的來(lái)自Naja atra的蛋白質(zhì)Fig.3 Identified proteins of Naja atra from the three SEC elution peaks

對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較(見(jiàn)圖3),5個(gè)樣品的SEC第1、2、3個(gè)洗脫峰分別鑒定到來(lái)自Najaatra的26、26、22種蛋白質(zhì),其中10、5、5種蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì);5個(gè)樣品的3個(gè)SEC洗脫峰共鑒定到32種蛋白質(zhì),其中D3TTC2、D5LMJ3、Q7T1K6、Q9DEQ3、Q9YGI4為共同鑒定到的蛋白質(zhì)。圖4列舉了其經(jīng)非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到的蛋白質(zhì)種類及其Sequest得分。

圖4 5個(gè)樣品的SEC洗脫峰鑒定到的蛋白質(zhì)Fig.4 Identified proteins from SEC elution peaks of the five samplesThe score is the scoring of the proteins identified in each component that matched the Naja database in the Sequest engine.

2.3 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

在法醫(yī)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,進(jìn)行未知樣品的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要通過(guò)非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)提供樣品所含的蛋白質(zhì)信息或?qū)?yīng)的物種信息。這種非靶向篩查與靶向驗(yàn)證相結(jié)合的分析策略可提高未知樣品中蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確度[14]。在確認(rèn)樣品的蛋白質(zhì)或者物種來(lái)源信息后,常選取與目標(biāo)蛋白質(zhì)的特征肽段保留時(shí)間和MS/MS信息比對(duì)的策略進(jìn)行樣品中蛋白質(zhì)的分析鑒定。

考慮到多肽的MS/MS譜圖復(fù)雜性高,且相近物種存在多種同源性多肽的現(xiàn)象,一條多肽特征肽段并不足以歸屬到特征蛋白質(zhì)。在此,我們對(duì)非靶向篩查鑒定到的32種來(lái)自Najaatra的蛋白質(zhì)采用每種蛋白質(zhì)選取兩條特征肽段的PRM模式進(jìn)行靶向驗(yàn)證。國(guó)際禁化武組織指南認(rèn)為[22],當(dāng)兩條特征肽段均滿足至少75%的與理論碎片相匹配的y+和b+離子的Δm/z小于5 ppm時(shí),可確證相應(yīng)蛋白質(zhì)的存在。我們即在此采用該嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)以盡可能排除假陽(yáng)性。圖5展示了進(jìn)行PRM靶向驗(yàn)證的蛋白質(zhì)的提取離子流色譜圖。每個(gè)樣品中的3個(gè)SEC組分在非靶向篩查中鑒定到的全部蛋白質(zhì)均符合該標(biāo)準(zhǔn)。因此,進(jìn)一步確證出5個(gè)樣品中蛋白質(zhì)的物種來(lái)源均為Najaatra。

在靶向驗(yàn)證中,特征肽段的界定與選擇以及使用兩條特征肽段對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行確證是否足夠充分或過(guò)于嚴(yán)格等問(wèn)題值得后續(xù)探究。目前,這種方法可能存在兩方面的問(wèn)題,一是低估非特征肽段所提供的信息,二是肽段的特征性與選取的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)。當(dāng)只考慮人類蛋白質(zhì)組時(shí),一種特定人類蛋白質(zhì)的特征肽段可能在哺乳動(dòng)物中廣泛共享[23]。此外,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)將不斷擴(kuò)大,新增加的蛋白質(zhì)亦會(huì)造成原有特征肽段可能失去其特征性[13]。

我們對(duì)經(jīng)靶向驗(yàn)證的32種蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的分類分析,確定其可歸屬于Najaatra的10種蛋白質(zhì)家族,圖6展示了它們之間的進(jìn)化關(guān)系。這10種蛋白質(zhì)家族分別是三指毒素(17種)、金屬蛋白酶(4種)、磷脂酶A2(3種)、富含半胱氨酸的分泌蛋白(2種)、肽酶S1(1種)、kunitz肽(1種)、利鈉肽(1種)、5′-核酸酶(1種)、黃素單胺氧化酶家族(1種)和核苷酸焦磷酸酶(1種)。三指毒素是眼鏡蛇毒液中含量最豐富的蛋白質(zhì)家族[24],可大致分為細(xì)胞毒素、α-神經(jīng)毒素、κ-神經(jīng)毒素和毒蕈堿毒素[25]。我們共鑒定到12種細(xì)胞毒素,這與眼鏡蛇毒液又被歸類為細(xì)胞毒性毒液[26]相符合。另一方面,較之我們以前的針對(duì)樣品E的分析鑒定工作[14],該工作使用UPLC-MS/MS,使用Swiss-Prot注釋驗(yàn)證庫(kù)和Uniprot注釋驗(yàn)證和未驗(yàn)證庫(kù),鑒定到歸屬于Najaatra、Najanaja、Najakaouthia、Najamelanoleuca、Najasputatrix、Najanivea、Najaannulifera的共計(jì)15種蛋白質(zhì),此次鑒定到的32種來(lái)自Najaatra的蛋白質(zhì)涵蓋了原鑒定到的10種Najaatra蛋白質(zhì)中的7種,但多鑒定出25種蛋白質(zhì),此點(diǎn)歸屬于Nano LC提升靈敏度以及使用較長(zhǎng)梯度洗脫程序(90 min)的貢獻(xiàn)。未鑒定到的3種蛋白質(zhì)中,P60304和P80958在本工作中僅歸屬了一條特征肽段,未匹配到E2IU03。

圖5 PRM驗(yàn)證蛋白質(zhì)的特征肽段提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of unique peptides of proteins by parallel reaction monitoring (PRM)A total of 64 peptides for 32 proteins are shown,where -1 and -2 represent two separate unique peptides.

圖6 來(lái)自于5個(gè)樣品的32種鑒定蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Evolution tree of 32 identified proteins in five samples Taking the first row as an example,sp,P01443,N2,3SA4 NAJAT Cytotoxin 4,OS Naja atra,81 AAs,9.1 kDa,pI 9.01 represent the validated protein database,UniProt number of protein,nth protein from Naja atra,function of protein,species source,number of amino acids,relative molecular mass,and isoelectric point,respectively.

3 結(jié)論

本研究采用Nano LC-MS/HRMS法分析鑒定疑似蛇毒樣品中蛋白質(zhì)的物種來(lái)源。首先對(duì)經(jīng)尺寸排阻色譜分離和胰蛋白酶溶液內(nèi)酶解的樣品進(jìn)行非靶向采集,提出多次收斂蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的思路,在5個(gè)樣品的3個(gè)SEC洗脫峰中共鑒定到32種來(lái)自Najaatra的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的逐級(jí)收斂結(jié)合嚴(yán)格肽段鑒定規(guī)則(PSM、肽段FDR值、特征肽段數(shù)量)有效提高了蛋白質(zhì)的鑒定準(zhǔn)確度。然后,采用PRM靶向采集模式結(jié)合肽段理論碎片嚴(yán)格閾值的手段對(duì)樣品中鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。最終成功鑒定出5個(gè)疑似蛇毒樣品均含有來(lái)源于Najaatra的蛇毒。該分析策略可為蛇毒中毒的司法案件鑒定、臨床中毒救治以及蛇毒藥物研發(fā)提供有效的技術(shù)支持。