李楊洋,梅沁源,劉紫茵,尹麗純,王星爍,陳則友

櫻桃蘿卜對(duì)抗生素的富集及其潛在風(fēng)險(xiǎn)

李楊洋,梅沁源,劉紫茵,尹麗純,王星爍,陳則友*

(南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300071)

為探究土壤抗生素污染的潛在生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn),于2021年6～9月進(jìn)行溫室土培櫻桃蘿卜試驗(yàn),每隔6d向土壤中施用土霉素(OTC)或鏈霉素(STR)污水,并對(duì)其中生長(zhǎng)的櫻桃蘿卜的生物量、蘿卜組織抗生素含量和菌群耐藥性進(jìn)行分析.同時(shí),通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)商法、攝入量計(jì)算和小鼠飼喂試驗(yàn)對(duì)蘿卜植株殘留的抗生素和抗性細(xì)菌的潛在人體健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估.結(jié)果表明,與未施用抗生素對(duì)照組相比,OTC的連續(xù)施用在第74d顯著促進(jìn)了蘿卜植株生長(zhǎng),使其總生物量提高了23.1%,而STR的連續(xù)施用對(duì)蘿卜植株的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響;蘿卜植株對(duì)土壤中施入的兩種抗生素均有一定的富集能力,STR在組織中的殘留量高于的OTC 1～2個(gè)數(shù)量級(jí),抗生素在植物生長(zhǎng)初期主要富集在葉中,生長(zhǎng)后期在肉質(zhì)根根頸部中的富集量顯著增加(<0.05);抗生素的施用使蘿卜植株組織中可培養(yǎng)OTC和STR抗性細(xì)菌占總可培養(yǎng)細(xì)菌的比率分別增加了2.48×10-6%～5.05×10-4%和0.19%～3.32%;食用經(jīng)抗生素暴露后的蘿卜肉質(zhì)根根頸部可增加機(jī)體對(duì)抗生素和抗生素抗性細(xì)菌的攝入量,但其健康風(fēng)險(xiǎn)較低(評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)商指數(shù)HQ<0.1、食用蘿卜植株的小鼠糞便中抗生素的含量低于檢出限).

土霉素(OTC)；鏈霉素(STR)；櫻桃蘿卜；富集特征；抗生素抗性細(xì)菌；健康風(fēng)險(xiǎn)

作為大量應(yīng)用的抗生素,土霉素(OTC)和鏈霉素(STR)在畜禽糞便、再生水和農(nóng)業(yè)土壤中廣泛存在[1-2].據(jù)報(bào)道,土壤中OTC和STR的濃度普遍在ng/kg至mg/kg范圍內(nèi),在部分地區(qū)土壤中的濃度甚至可達(dá)上百mg/kg[3-4].土壤中的OTC和STR除少部分來(lái)自土著微生物的天然合成外,其主要來(lái)自污水灌溉過(guò)程、污泥還田和畜禽糞便施用等人為過(guò)程[5].

殘留在土壤中的抗生素可能會(huì)對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境、植物和人體健康均造成一定的負(fù)面影響.已有研究發(fā)現(xiàn)土壤中殘留的抗生素能被黃瓜、土豆、生菜等植物吸收并對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[6-7].抗生素能富集在植物的葉、根和莖等組織中[8].有研究發(fā)現(xiàn)低濃度的抗生素對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,但中高濃度的抗生素則可能會(huì)抑制植物生長(zhǎng)[9].進(jìn)入土壤的抗生素還會(huì)對(duì)植物和土壤的微生物群落施加一定程度的選擇壓力,使抗性細(xì)菌大量繁殖,抗性基因豐度不斷增加[10].有研究表明四環(huán)素的暴露會(huì)改變土壤和植物的菌群結(jié)構(gòu),改變可培養(yǎng)細(xì)菌和抗性細(xì)菌的數(shù)量,提升耐藥細(xì)菌的比例[11-12].但現(xiàn)有的研究大多關(guān)注抗生素在單次或幾次暴露過(guò)程中的影響,而對(duì)于長(zhǎng)期抗生素的連續(xù)暴露過(guò)程關(guān)注較少.然而,實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的污水灌溉、畜禽糞便施用等過(guò)程往往需要多次反復(fù)地進(jìn)行.因此,研究抗生素在連續(xù)暴露過(guò)程中在植物中的富集及其對(duì)植物生長(zhǎng)和植物菌群的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.此外,對(duì)于生長(zhǎng)在抗生素污染土壤中的植物的人體健康風(fēng)險(xiǎn)仍需進(jìn)一步的研究.

蘿卜作為一類可生食的大眾蔬菜,其生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)過(guò)程需要充足的水分,使得蘿卜的品質(zhì)極易受到土壤抗生素污染的影響.為此,本文以櫻桃蘿卜為研究對(duì)象,分析了OTC和STR在連續(xù)灌溉過(guò)程中在植物組織中的富集特征,并探究了其對(duì)櫻桃蘿卜生長(zhǎng)及櫻桃蘿卜不同組織抗性細(xì)菌的影響.與此同時(shí),初步評(píng)估了蘿卜組織中富集的抗生素和抗性細(xì)菌的健康風(fēng)險(xiǎn).本研究對(duì)于理解土壤抗生素污染可能存在的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物為十字花科的櫻桃蘿卜(),種子購(gòu)買于山東禾之元種業(yè)公司.栽培櫻桃蘿卜的土壤由采自南開(kāi)大學(xué)津南校區(qū)校園的土壤和采購(gòu)于山東禾之元種業(yè)公司的果蔬種植基質(zhì)(主要成分為草炭、蛭石和珍珠巖)按1:2(M:M)比例均勻混合而得,為植物生長(zhǎng)提供充足的養(yǎng)分.供試土壤pH 7.21,土壤含水量(重量%) 38.7%,陽(yáng)離子交換量45.68cmol/kg,機(jī)械組成0.02%黏粒(<2μm)、19.88%粉粒(2～50μm)、80.10%砂粒(50～2000μm),有機(jī)質(zhì)含量為309.16g/kg,全氮11.89g/ kg,全磷3.61g/kg,速效鉀1.03g/kg.OTC和STR標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,HPLC級(jí).

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)于2021年6月～9月在南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行.試驗(yàn)開(kāi)始前,在每個(gè)花盆中分別放入450g供試混合土壤,隨后將3～4粒用去離子水浸泡8h的櫻桃蘿卜種子播種到土壤中央2～3cm深處并給予充足水分.緊接著根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)是否施用抗生素將花盆標(biāo)記為3組:空白對(duì)照組(Control)、土霉素處理組(OTC)和鏈霉素處理組(STR),每組12～13盆.待植物長(zhǎng)出后,每隔2～3d給植物澆水100mL.植物生長(zhǎng)的環(huán)境條件為:溫度20～ 26℃、濕度40%～60%、16h光照:8h黑暗,植物生長(zhǎng)期間不施用任何肥料.在植物生長(zhǎng)至第21d開(kāi)始進(jìn)行抗生素施用試驗(yàn):通過(guò)直接澆灌的方式向抗生素處理組土壤中加入100mL濃度為4mg/L的OTC或STR溶液,并每隔6d施用一次,空白對(duì)照組則每次澆灌相同體積的去離子水.研究中單次施加的抗生素濃度換算至土壤干重質(zhì)量濃度為1.45mg/kg,該濃度可模擬長(zhǎng)期施用畜禽糞便、污泥或污水的農(nóng)田土壤的抗生素污染水平[13].抗生素連續(xù)施用4次后,在第44d每組隨機(jī)選擇5盆植株進(jìn)行取樣.剩余的7～8盆植株繼續(xù)施用抗生素,第5次抗生素施用濃度仍然保持在4mg/L之后將抗生素濃度進(jìn)一步提高至40mg/L,并持續(xù)使用4次,在第74d每組再取5盆植株進(jìn)行取樣.40mg/L的抗生素濃度換算至土壤干重質(zhì)量濃度為14.5mg/kg,該濃度用以模擬土壤中抗生素高度污染的情景.最后,對(duì)每組剩余的2盆植株繼續(xù)施用1次40mg/L抗生素后于第98d取樣.取樣過(guò)程均為將整株櫻桃蘿卜從土壤中剝離,并按照葉、肉質(zhì)根的根頸部和側(cè)根將植株分成3部分.與此同時(shí),采集植物的根際土并對(duì)所有樣品稱重記錄.

將上述第44d和第74d取得的植物組織樣品和土壤樣品進(jìn)一步分成單獨(dú)的幾小份,其中一份稱重、研碎后冷凍干燥并儲(chǔ)存在-80℃下,用于提取抗生素.此外,選取第74d獲得的部分樣品,經(jīng)稱重、研碎后與無(wú)菌PBS溶液以1:1(V:V)的比例混合,儲(chǔ)存于4℃條件下用于分菌.第98d獲得的葉和肉質(zhì)根根頸部樣本則全部懸浮于200mL PBS溶液并榨成汁后飼喂小鼠.實(shí)驗(yàn)中將70只6～8周齡體重(20±3) g的雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行不處理飼養(yǎng)一周以平衡腸道菌群后,隨機(jī)分成7組,每組10只,一組每天只喂飼料,其他6組每天喂飼料的同時(shí)灌喂0.6mL來(lái)自不同抗生素處理組的葉子汁或肉質(zhì)根根頸部汁,2周后,收集小鼠的糞便,用于提取抗生素.

1.3 樣品分析方法

1.3.1 抗生素含量測(cè)定 使用QuEChERS方法[14]提取上述采集的植物組織、土壤以及小鼠糞便中的抗生素.QuEChERS方法常用于提取檢測(cè)植物中的抗生素類化學(xué)物質(zhì),其回收率高達(dá)71%～93%[15].過(guò)程如下:取凍干的葉和土壤樣品各250mg、肉質(zhì)根根頸部100mg,分別加入2mL 150mg/L的Na2EDTA,混合1min后加入適量玻璃珠,并加入1.75mL甲醇,均質(zhì)1.5min;隨后加入2g Na2SO4和0.5g NaCl,再次均質(zhì)1.5min,并以5050g離心10min后收集上清液;離心剩余物加入3.25mL乙腈,并5050g離心10min,收集上清液;混合前兩步的上清液,取1.2mL混合液加入d-SPE(d-SPE配制:12.5mg C18;12.5mg PSA;225mg Na2SO4),均質(zhì)1min,9240g離心10min;取上清液0.9mL,加入提前準(zhǔn)備好的裝有0.1mL甲醇的離心管,并經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后裝入進(jìn)樣瓶.

使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MRM), OA_SPE Waters Xevo TQ_S串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司)進(jìn)行抗生素含量測(cè)定.使用WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1′50mm, 1.7μm)測(cè)定OTC含量,具體為柱溫:40℃;進(jìn)樣體積: 10μL,流速:0.45mL/min.二元梯度泵,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液.梯度洗脫順序: 0min,90% A;1.5min,84% A;2.0min,82% A;3.0min, 78% A;4.0min,65% A;4.5min,40% A;6.5min,5% A; 7.1min,90% A;10min,90% A.離子源:電噴霧電離(ESI+);毛細(xì)管電壓:3.5kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣溫度:350℃;碰撞氣流速:0.15mL/min;檢測(cè)方式:MRM.吸取待測(cè)溶液500μL到新的進(jìn)樣瓶里并加入500μL流動(dòng)相B.使用Waters Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱(2.1×100mm, 1.7μm)測(cè)STR[16],二元梯度泵,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為200mmol/L甲酸銨水溶液(pH 4.0).其他質(zhì)譜條件參見(jiàn)表1.

1.3.2 可培養(yǎng)細(xì)菌和抗生素抗性細(xì)菌的分離與分析 取上述用于分菌的菌懸液樣品,以合適的倍數(shù)稀釋后分別涂布于不含抗生素和含有100mg/L OTC或STR的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上,放在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后進(jìn)行計(jì)數(shù).細(xì)菌耐藥率(即可培養(yǎng)抗生素抗性細(xì)菌占總可培養(yǎng)細(xì)菌的比例)通過(guò)每g植物或土壤中分離的抗性細(xì)菌數(shù)除以每g植物或土壤的總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)而得.隨后在兩種抗性板中選出形態(tài)、顏色等表觀特征不一樣的單菌落,將其挑出并用平板劃線法在LB培養(yǎng)基上劃線,37℃恒溫靜態(tài)培養(yǎng)24h,得到純化后的細(xì)菌,將單菌落挑出放入LB液體培養(yǎng)基中,并在37℃搖床中培養(yǎng)8h后將500μL菌液與甘油以1:1(:)的比例混合后保存在-20℃冰箱,剩余菌液進(jìn)行16S rDNA菌種鑒定.

表1 土霉素(OTC)和鏈霉素(STR)的質(zhì)譜參數(shù)

注:1)定量離子.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003記錄數(shù)據(jù),用Origin 2022作圖,所得數(shù)據(jù)運(yùn)用IBM SPSS Statistics V21.0軟件進(jìn)行方差分析(One-way ANOVA)和顯著性分析,α = 0.05為顯著水平.植物對(duì)抗生素的富集可以用生物富集系數(shù)(BEF)值表示,采用公式(1)計(jì)算;抗生素在土壤中的殘留可以用土壤殘留率(SRR)體現(xiàn),采用公式(2)計(jì)算;人體通過(guò)飲食攝入抗生素的每日預(yù)測(cè)攝入量(EDI),采用公式(3)計(jì)算;抗生素對(duì)人體健康的威脅用風(fēng)險(xiǎn)商(HQ)表示,采用公式(4)計(jì)算;人體通過(guò)飲食攝入抗生素抗性細(xì)菌的每日預(yù)測(cè)攝入量(RBI),采用公式(5)計(jì)算.

式中:antibiotic為食品中抗生素含量,ng/g,以干重計(jì); IRveg為每天食用的蔬菜/水果量(杯),其中,成人每天食用蔬菜/水果為3.45杯,兒童每天食用蔬菜/水果為2.86杯[17];g/cup為一杯新鮮植物組織的質(zhì)量,g/杯,以濕重計(jì),一杯櫻桃蘿卜的質(zhì)量為135.5g/杯[18];WW/DW為植物組織平均濕重干重轉(zhuǎn)化因子,表示1g植物組織(以濕重計(jì))的干重,一般取0.085[19];為人體平均體重,kg,根據(jù)中國(guó)2014年國(guó)民體質(zhì)監(jiān)測(cè)公報(bào),本文設(shè)定25kg為兒童的平均體重,60kg為成年人平均體重[20];ADI為在不產(chǎn)生不良影響的前提下每人每天最多攝入的抗生素的量,STR選取10mg/(kg·d),OTC選取5.7mg/(kg·d)[18];bacteria為食品中抗生素抗性細(xì)菌的數(shù)量,個(gè)/g,以濕重計(jì).

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對(duì)蘿卜植株生物量的影響

圖1 OTC和STR對(duì)蘿卜植株生物量的影響

WW表示濕重,下同;“-44”表示植物生長(zhǎng)第44d取樣,“-74”表示植物生長(zhǎng)第74d取樣,下同;不同小寫(xiě)字母代表各豎分隔線內(nèi)所有處理間存在顯著性差異(<0.05),下同

為了模擬實(shí)際應(yīng)用中連續(xù)的再生水灌溉、污泥還田和畜禽糞便施用過(guò)程,本試驗(yàn)中抗生素的暴露采取了多次施用的方式進(jìn)行.與此同時(shí),考慮到不同介質(zhì)中抗生素濃度存在差異,本試驗(yàn)也將抗生素的施用濃度設(shè)置為2個(gè)階段,第一階段(21～44d)的抗生素施用濃度設(shè)置為4mg/L,換算到土壤中的濃度約為1.45mg/kg(以干重計(jì)),而第二階段(44～74d)的抗生素濃度由4mg/L提高到40mg/L,對(duì)應(yīng)土壤濃度約為14.5mg/kg(以干重計(jì)).本文中抗生素濃度的選擇主要依據(jù)土壤中抗生素的污染水平,且用以模擬土壤發(fā)生較高污染程度的情景.由圖1可知,23d的OTC和STR連續(xù)施用對(duì)蘿卜植株葉、地下部和總植株生物量均沒(méi)有顯著影響.53d的STR連續(xù)施用對(duì)蘿卜植株各部分生物量仍無(wú)顯著影響,但53d的OTC連續(xù)施用顯著地增加了蘿卜植株的總生物量(較對(duì)照組提高了23.1%),且植株的葉和地下部分(尤其是地下部分)均有一定程度的增加.

2.2 抗生素在土壤和植物組織中的富集特征

圖2 土壤和蘿卜植株不同組織中的OTC和STR含量

DW表示干重

表2 土壤的抗生素殘留率(SRR)和蘿卜植株的生物富集系數(shù)(BEF)

抗生素在土壤和植物組織中的富集特征如圖2所示,在第44d對(duì)照組植物的葉中存在一定含量的STR,第74d其STR含量大大減少.植物生長(zhǎng)第44d和74d時(shí)抗生素處理組的土壤和植物中抗生素的含量均高于對(duì)照組,說(shuō)明施用的抗生素在土壤中有所富集且部分抗生素被植物所吸收.與此同時(shí),葉中富集的兩種抗生素含量高于肉質(zhì)根根頸部.對(duì)比兩種抗生素可發(fā)現(xiàn)STR在植物組織中的檢出濃度高于OTC.抗生素在土壤和植物組織的殘留狀況和富集系數(shù)顯示(表2),抗生素在土壤中的殘留率極低,最高殘留率不足1%.在第44d,OTC處理組和STR處理組的兩組植物中葉中OTC和STR含量均最高,富集系數(shù)分別為0.23%和1.04%.在第74d,STR處理組的土壤中STR含量減少,葉和肉質(zhì)根根頸部中STR的含量均增加,植物中葉中STR含量依舊最高,肉質(zhì)根根頸部中STR的含量也有提高,其在葉和肉質(zhì)根根頸部中的富集系數(shù)分別為0.73%和0.55%;對(duì)于OTC組來(lái)說(shuō),此階段葉中OTC含量減小,其富集系數(shù)減小了0.22%,肉質(zhì)根根頸部中OTC含量增加,其富集系數(shù)變化不大.

2.3 抗生素對(duì)蘿卜植株不同組織內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌及抗生素抗性細(xì)菌的影響

圖3 不同處理組植物組織和土壤中總可培養(yǎng)細(xì)菌、抗生素抗性細(xì)菌數(shù)量以及耐藥率

圖4 不同處理組植物和土壤中的OTC(a)及STR(b)抗性細(xì)菌

如圖3所示,未施用抗生素的蘿卜植株各組織中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量呈葉>肉質(zhì)根根頸部>根順序遞減,施用抗生素后葉中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減小了2～3個(gè)數(shù)量級(jí),而肉質(zhì)根根頸部和根中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量增加了1～5個(gè)數(shù)量級(jí).蘿卜植株不同組織中OTC或STR抗性細(xì)菌占總可培養(yǎng)細(xì)菌的比例(即菌群耐藥率)可以反映抗生素脅迫下植物菌群中抗生素抗性的變化.結(jié)果顯示,對(duì)照組植物組織中無(wú)OTC抗性細(xì)菌,但OTC處理組蘿卜植株的各組織中均出現(xiàn)了OTC抗性細(xì)菌,其中葉、肉質(zhì)根根頸部和根中菌群對(duì)OTC的耐藥率分別為5.05×10-4%、1.60×10-4%和2.48×10-6%.菌種鑒定結(jié)果顯示(圖4(a)),葉中的OTC抗性細(xì)菌主要來(lái)自葡萄球菌屬、泛菌屬和勒氏菌屬,肉質(zhì)根根頸部中的OTC抗性細(xì)菌主要為假單胞菌屬,根中的OTC抗性細(xì)菌主要來(lái)自假單胞菌屬和芽孢桿菌屬.有趣的是,與OTC處理不同,雖然對(duì)照組肉質(zhì)根根頸部和根中仍無(wú)STR抗性細(xì)菌,但對(duì)照組植物葉中存在部分STR抗性細(xì)菌.施用STR后,植物葉中STR抗性細(xì)菌的數(shù)量減小了2個(gè)數(shù)量級(jí),但STR抗性細(xì)菌種類有所增加.對(duì)照組的STR抗性細(xì)菌主要來(lái)自戴爾福特屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬,而STR處理組的STR抗性細(xì)菌主要來(lái)自微小桿菌屬、噬脯氨酸菌屬、戴爾福特屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬.經(jīng)STR暴露后,處理組的肉質(zhì)根根頸部和根中均出現(xiàn)了抗性細(xì)菌,肉質(zhì)根根頸部和根中菌群對(duì)STR的耐藥率分別為0.19%和1.35%,肉質(zhì)根根頸部和根中的STR抗性細(xì)菌主要來(lái)自假單胞菌屬.對(duì)于同一組植物的相同組織,在兩種抗生素脅迫下蘿卜植株菌群對(duì)兩種抗生素的耐藥率均為STR>OTC.在同一種抗生素的脅迫下,蘿卜植株葉中菌群的耐藥率均高于肉質(zhì)根根頸部中菌群的耐藥率.

2.4 抗生素對(duì)土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌及抗生素抗性細(xì)菌的影響

由圖3可知,施用抗生素后,土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、菌群耐藥率和抗生素抗性細(xì)菌的種類變化均不明顯,對(duì)照組中OTC抗性細(xì)菌主要來(lái)自于假單胞菌屬,OTC處理組中的OTC抗性細(xì)菌主要來(lái)自于假單胞菌屬和葡萄球菌屬;對(duì)照組中STR抗性細(xì)菌主要來(lái)自于芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、貪銅菌屬、蒼白桿菌屬和假單胞菌屬,STR處理組的STR抗性細(xì)菌主要來(lái)自于芽孢桿菌屬、根瘤菌屬和假單胞菌屬.在兩種抗生素脅迫下土壤菌群的耐藥率為STR>OTC.

2.5 蘿卜植株中的抗生素和抗生素抗性細(xì)菌的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

蘿卜植株中的抗生素和抗生素抗性細(xì)菌可通過(guò)飲食進(jìn)入人體,對(duì)人類健康造成潛在威脅.由表3可知,植物生長(zhǎng)第44d時(shí)兩種抗生素的每日預(yù)測(cè)攝入量(EDI)和風(fēng)險(xiǎn)商(HQ)均為葉>肉質(zhì)根根頸部;第74d時(shí)STR的EDI和HQ同樣為葉>肉質(zhì)根根頸部,而OTC的EDI和HQ則為肉質(zhì)根根頸部>葉.由于兒童每日食用的蔬菜相對(duì)于自身體重的比值更高,因此食用被抗生素污染的櫻桃蘿卜對(duì)兒童健康的威脅大于成人.在所有處理組中HQ均小于0.1.小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示,食用了不同處理組葉和肉質(zhì)根根頸部的小鼠糞便中抗生素的含量均低于最低檢出限.本研究也對(duì)抗生素抗性細(xì)菌的人體攝入量進(jìn)行了計(jì)算評(píng)估.由表4可知,通過(guò)食用含有抗性細(xì)菌蘿卜植株,人體OTC抗性細(xì)菌的預(yù)測(cè)攝入量為 (1.72± 3.36)×103～(6.47±9.06)×104個(gè)/(kg·d),STR抗性細(xì)菌的每日預(yù)測(cè)攝入量為(0.74±1.20)×106～(1.54±2.39)× 108個(gè)/(kg·d).與對(duì)照組相比,兩種抗生素的施用均增加了肉質(zhì)根根頸部中的抗性細(xì)菌每日攝入量.考慮到肉質(zhì)根根頸部具有可食用性,該結(jié)果證實(shí)土壤抗生素污染可能導(dǎo)致人體攝入更多的抗性細(xì)菌.

表3 通過(guò)食用蘿卜植株而導(dǎo)致的抗生素?cái)z入量估算

注:數(shù)值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n = 4)后的不同小寫(xiě)字母表示分隔線內(nèi)同一列存在顯著性差異(<0.05),下同.

表4 通過(guò)食用蘿卜植株而導(dǎo)致的抗生素抗性細(xì)菌攝入量估算

3 討論

3.1 OTC和STR對(duì)蘿卜植株生物量的影響

在本文中,53d的OTC連續(xù)施用對(duì)蘿卜植株生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用.之前也有部分研究發(fā)現(xiàn)抗生素能促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6].遲蓀琳等[21]發(fā)現(xiàn)50mg/kg四環(huán)素對(duì)土培小白菜地下部分的生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用.鮑陳燕等[22]發(fā)現(xiàn)水培條件下低濃度(50～ 100μg/L)的抗生素污染可增加水芹根系生長(zhǎng),使根系活力增加.抗生素促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)理可能存在以下幾種可能:一是抗生素的脅迫使植物代謝增強(qiáng),以促進(jìn)植物生長(zhǎng).研究表明,低濃度的抗生素能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成以及線粒體數(shù)目的增加[22-23];二是低濃度的抗生素使植物體內(nèi)抗氧化酶活性增加,從而清除活性氧自由基保護(hù)植物生長(zhǎng)[24];三是抗生素能改變植物菌群的結(jié)構(gòu),從而有利于植物的生長(zhǎng).

本研究結(jié)果也顯示,相較葉子,OTC對(duì)地下部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更為明顯,這可能是由于生長(zhǎng)在土壤中的地下部與抗生素接觸更為直接.此外,本研究也發(fā)現(xiàn)STR施用對(duì)蘿卜植株的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響,表明抗生素污染對(duì)植物的影響也取決于抗生素的種類.

3.2 土壤和植物組織中OTC和STR的富集特征

本試驗(yàn)結(jié)果顯示土壤中抗生素的殘留率極低.其原因一方面是抗生素進(jìn)入到土壤后會(huì)經(jīng)歷多種生物和非生物降解過(guò)程[25],導(dǎo)致其殘留量降低;另一方面,一部分進(jìn)入土壤中的抗生素也會(huì)被植物吸收從而減少土壤中的抗生素含量[26].此外,抗生素會(huì)通過(guò)物理吸附、化學(xué)結(jié)合或生物固定作用而殘留在土壤固相基質(zhì)中,而相對(duì)較為溫和的提取條件可能導(dǎo)致QuEChERS方法不能完全提取土壤中的抗生素[10,27].

抗生素可通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)運(yùn)輸被植物根部吸收,隨后通過(guò)根部的凱氏帶運(yùn)輸,并通過(guò)木質(zhì)部的蒸騰流在植物體內(nèi)運(yùn)輸,此過(guò)程中不斷將抗生素分配至臨近的植物組織部位[28].植物對(duì)抗生素吸收運(yùn)輸?shù)耐緩脚c植物類型、抗生素種類等有關(guān)[29].本研究發(fā)現(xiàn)抗生素處理組植物的葉和肉質(zhì)根根頸部中抗生素的含量均高于對(duì)照組,證實(shí)了土壤中的抗生素會(huì)被植物吸收并隨蒸騰作用在植物的不同組織間運(yùn)輸并富集.與此同時(shí),本研究也發(fā)現(xiàn)葉中富集的兩種抗生素濃度均高于肉質(zhì)根根頸部,且植物生長(zhǎng)后期肉質(zhì)根根頸部中抗生素的富集量顯著增加(<0.05).這可能與櫻桃蘿卜植株的生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān),櫻桃蘿卜植株以先長(zhǎng)葉子再長(zhǎng)肉質(zhì)根為基本特征,更長(zhǎng)的抗生素富集時(shí)間可能是葉子中富集更多抗生素的主要原因,而生長(zhǎng)階段的變化可能是后期肉質(zhì)根根頸部中抗生素富集量增加的原因.在本研究中,蘿卜植株對(duì)STR的富集能力高于OTC,這說(shuō)明植物對(duì)抗生素的吸收富集與抗生素本身的理化性質(zhì)有關(guān)[21].研究發(fā)現(xiàn)抗生素的分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及辛醇水分配系數(shù)等特性均可影響其在植物中的富集情況.由于OTC分子結(jié)構(gòu)中含有酚二酮官能團(tuán),其極易與土壤介質(zhì)中的金屬離子結(jié)合形成螯合物而強(qiáng)烈吸附于土壤顆粒上[30],因此OTC較難被植物吸收富集.經(jīng)檢測(cè),供試土壤和蘿卜植株種子中分別存在0.54和1.34ng/g的STR殘留,這可能是第44d對(duì)照組植株的葉中存在一定含量的STR的原因.而抗生素在植物中的生物和非生物降解過(guò)程可能是第74d其STR含量大大減少的主要原因.

3.3 OTC和STR對(duì)土壤和蘿卜植株菌群的影響

在本試驗(yàn)中,抗生素的連續(xù)施用使植物葉中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減小,其原因可能是抗生素會(huì)抑制不具有抗生素抗性細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖.研究表明,OTC和STR都能特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合,抑制肽鏈的延長(zhǎng)進(jìn)而影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[31].抗生素對(duì)細(xì)菌的毒性大小主要取決于細(xì)菌種屬、抗生素類型以及抗生素的濃度和作用時(shí)間等.與葉部相反,抗生素的連續(xù)施用增加了植物肉質(zhì)根根頸部中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量,其機(jī)理可推測(cè)為抗生素能促進(jìn)肉質(zhì)根根頸部的生長(zhǎng),抗生素處理組植物為其中細(xì)菌的生長(zhǎng)提供更多的營(yíng)養(yǎng)和棲息地.植物細(xì)菌可通過(guò)產(chǎn)生具有促生、抗菌等作用的代謝產(chǎn)物和固定營(yíng)養(yǎng)元素,來(lái)促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖[32],抗生素處理組植物肉質(zhì)根根頸部的生物量顯著大于對(duì)照組也可能與其細(xì)菌數(shù)量增加有關(guān).

本研究發(fā)現(xiàn),抗生素的連續(xù)施用可使植物各組織的耐藥率增加,這與大多數(shù)已報(bào)道的研究結(jié)果一致.Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中分別加入8和16mg/L的四環(huán)素后,小白菜中可培養(yǎng)抗生素抗性細(xì)菌的數(shù)量增加了2～3倍,耐藥率也從0.23%提升到0.79%～1.23%.Yashiro等[34]報(bào)道噴灑STR后蘋果樹(shù)葉片中菌群的耐藥率提升了30%.施用抗生素后,抗生素會(huì)進(jìn)入并富集在植物內(nèi)部,使抗生素抗性細(xì)菌獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),從而增加植物組織中抗性細(xì)菌的比例.同時(shí),抗生素抗性基因還可通過(guò)水平轉(zhuǎn)移在同種細(xì)菌或異種細(xì)菌間傳播[35],進(jìn)一步提升抗性細(xì)菌的比例和種類.在本試驗(yàn)中,植物組織中的抗性細(xì)菌主要為葡萄球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬等.在一定條件下,這些細(xì)菌對(duì)植物、動(dòng)物和人類具有致病性,例如,假單胞菌可以感染蘋果樹(shù)使其產(chǎn)生疾病[36],魯氏不動(dòng)桿菌是人類的條件致病菌[37].這些細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性不僅會(huì)導(dǎo)致植物疾病難以治愈,還可能通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,危害人類健康.與此同時(shí),本研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜植株中STR耐藥細(xì)菌的比例和種類都遠(yuǎn)大于OTC耐藥細(xì)菌,其可能的原因可能為STR更容易被植物吸收富集,因此其更易對(duì)植物菌群耐藥率和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.在本試驗(yàn)中,對(duì)照組植物葉子中存在高濃度的STR殘留以及1.09%的STR耐藥細(xì)菌.之前已有研究報(bào)道了STR耐藥性的廣泛性,例如,Yashiro[34]發(fā)現(xiàn)沒(méi)有噴灑STR的蘋果樹(shù)葉片中菌群耐藥率已高達(dá)50%.此外,本研究中抗生素的施用對(duì)土壤細(xì)菌的數(shù)量、土著菌群耐藥率和抗生素抗性細(xì)菌的種類影響均較小,其原因可能是本試驗(yàn)所用的土壤中有機(jī)質(zhì)含量較高,從而導(dǎo)致OTC和STR的生物可利用性較小[38].

3.4 OTC和STR施用的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

施用過(guò)抗生素的蘿卜植株被人體食用后可能會(huì)對(duì)人體健康造成威脅.一方面,抗生素大量富集在櫻桃蘿卜的可食用部位(葉和肉質(zhì)根根頸部),可通過(guò)食用進(jìn)入人體腸道中.抗生素及其代謝產(chǎn)物可能通過(guò)影響腸道微生物的數(shù)量、多樣性和抗生素抗性而對(duì)人類健康造成影響.另一方面,由抗生素暴露引起的蘿卜植株中的抗生素抗性細(xì)菌和抗性基因也會(huì)通過(guò)食物鏈被人體攝入,導(dǎo)致人體中抗性基因的增加以及具有抗生素抗性的致病菌的出現(xiàn),從而危害人體健康[39].在本試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,人體在食用抗生素處理組的葉或肉質(zhì)根根頸部的過(guò)程中會(huì)攝入3～4個(gè)數(shù)量級(jí)的OTC抗性細(xì)菌或5～7個(gè)數(shù)量級(jí)STR抗性細(xì)菌.

現(xiàn)階段,常使用風(fēng)險(xiǎn)商法來(lái)評(píng)估長(zhǎng)期食用含抗生素的食物(如水果、蔬菜、肉類等)對(duì)人類健康造成的威脅[17,40].風(fēng)險(xiǎn)商等于每日預(yù)計(jì)攝入量(EDI)除以每日最多攝入量(ADI),ADI是指在不產(chǎn)生不良影響的前提下,每人每天最多攝入的抗生素的量.通常認(rèn)為HQ>0.1表示對(duì)人類健康存在威脅[18-19].在本文中,所有處理組供試植株的HQ都小于0.1,后續(xù)的小鼠試驗(yàn)中小鼠糞便中的抗生素含量也均低于最低檢出限,說(shuō)明食用本研究中經(jīng)抗生素暴露的蔬菜對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)較小.大部分研究也表明食用OTC和STR處理的食物不會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅[18].Ahmed等[41]發(fā)現(xiàn)使用含四環(huán)素的溶液灌溉后的黃瓜、生菜和西紅柿的可食用部位中四環(huán)素濃度均在0.002～0.204mg/kg,均無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn);王衛(wèi)中等[42]揭示只有當(dāng)OTC在土壤中的含量大于450mg/kg時(shí),其對(duì)兒童的HQ略大于0.1,其他情況的HQ都小于0.1.值得注意的是,研究表明植物中抗生素濃度會(huì)隨著環(huán)境中抗生素濃度的增加而增加[33,42],而且不同植物對(duì)抗生素的富集能力存在較大的差異[21].因此,長(zhǎng)期施用含高濃度抗生素的再生污水、污泥或畜禽糞便可能導(dǎo)致抗生素富集能力較強(qiáng)的植物吸收大量抗生素且富集耐藥細(xì)菌,其可能會(huì)存在一定的健康風(fēng)險(xiǎn).因此,需要特別關(guān)注土壤中抗生素的濃度、糞污施用頻率以及抗生素污染土壤上種植的植物類型.

4 結(jié)論

4.1 53d OTC的連續(xù)施用可以增加蘿卜植株的總生物量(<0.05),而STR的連續(xù)施用并無(wú)顯著影響.

4.2 蘿卜植株對(duì)STR的富集能力強(qiáng)于OTC;抗生素在植物生長(zhǎng)初期主要富集在葉中,而生長(zhǎng)后期在肉質(zhì)根根頸部中的富集量顯著增加(<0.05).

4.3 抗生素的施用可提高蘿卜植株組織中菌群對(duì)供試抗生素的耐藥性,改變抗生素抗性細(xì)菌的種類,但其對(duì)土壤菌群的影響較小.

4.4 本試驗(yàn)中抗生素處理組蘿卜植株的食用對(duì)人體健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)很小(HQ<0.1).人體在食用抗生素處理組植物的過(guò)程中會(huì)攝入3～4個(gè)數(shù)量級(jí)的OTC抗性細(xì)菌或5～7個(gè)數(shù)量級(jí)的STR抗性細(xì)菌.

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Enrichment of antibiotics in cherry radish and its potential risk.

LI Yang-yang, MEI Qin-yuan, LIU Zi-yin, YIN Li-chun, WANG Xing-shuo, CHEN Ze-you*

(Department of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China)., 2023,43(1)：351～360

To explore the potential ecological and health risks of soil antibiotic pollution, a greenhouse pot experiment on cherry radishes was conducted from June to September 2021. Oxytetracycline (OTC) or streptomycin (STR) contaminated water was applied to soil every 6days, and the biomass, plant uptake of antibiotics, and the antibiotic resistance characteristics of the microbiome of cherry radish were analyzed. In addition, the potential human health risks of residual antibiotic and antibiotic-resistant bacteria (ARB) in radish plants were evaluated by risk quotient, calculation of intake index, and the mouse feeding tests. The results showed that continuous application of OTC significantly promoted the growth of radish plants and increased the total biomass of radish plants by 23.1% on 74 days compared with the non-antibiotic applied control group, while continuous application of STR had no significant effect on the growth of radish plants. Radish plants accumulated a certain amount of the applied two antibiotics, and the residual amount of STR in tissues was higher than OTC by 1～2 orders of magnitude. Antibiotics were mainly enriched in leaves at the early growth stage, and antibiotic residue in the neck of fleshy roots at the later growth stage was significantly increased (< 0.05). The proportion of culturable OTC- and STR-resistant bacteria in total culturable bacteria increased by 2.48×10-6%～5.05 ×10-4% and 0.19%～3.32%, respectively. Consumption of the neck of fleshy roots exposed to antibiotics could increase the body's intake of antibiotics and ARB, but the associated health risk was relatively low, as the assessed risk index HQ was less than 0.1 and the antibiotic residue in feces of mice eating radish plants was below the detection limit.

oxytetracycline (OTC)；streptomycin (STR)；cherry radish；plant enrichment；antibiotic resistance bacteria；health risk

X53

A

1000-6923(2023)01-0351-10

李楊洋(2001-),女,湖南湘潭人,本科生,主要從事環(huán)境微生物學(xué)的研究.

2022-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41977367);南開(kāi)大學(xué)本科生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(202110055797)

* 責(zé)任作者, 副教授, zeyou@nankai.edu.cn