王錦航，彭士雄，趙建廣，陳彥平，崔子峰

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占頭頸癌的90%[1]。目前臨床中多應(yīng)用腫瘤分期或組織學(xué)分級等指標(biāo)來評估OSCC患者的預(yù)后，存在導(dǎo)致部分低?；颊呓邮苓^度治療的可能或?qū)е虏糠指呶；颊咭蛑委煵蛔愣媾R復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，造成患者的預(yù)后差異較大[2]，可見，臨床上仍需挖掘OSCC中潛在的生物標(biāo)志物用于評估患者的預(yù)后。

自噬是維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，然而研究中逐漸發(fā)現(xiàn)自噬也可有助于腫瘤的發(fā)生或發(fā)展，如可使癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸從而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖[3-4]。目前已有學(xué)者嘗試通過自噬相關(guān)機制為OSCC尋找新的治療策略，但研究主要集中于自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，ARG)在OSCC發(fā)展或治療中的作用，缺乏通過大數(shù)據(jù)來篩選和鑒定ARG中可用于預(yù)測OSCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究將癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中OSCC相關(guān)ARG表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床病理特征及預(yù)后數(shù)據(jù)相結(jié)合，探究ARG風(fēng)險預(yù)測模型在OSCC預(yù)后中潛在的臨床應(yīng)用價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理 本研究應(yīng)用R軟件行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。從TCGA數(shù)據(jù)庫中共獲取501例OSCC樣本和44例癌旁樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)。在OSCC樣本中498例具有完整的預(yù)后數(shù)據(jù)，432例具有完整的性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤分期和T分期數(shù)據(jù)。通過Ensembl提供的“Homo_sapiens.GRCh38.104.chr.gtf.gz”文件行基因名稱注釋。

1.2 差異表達(dá)ARG的篩選 從HADb數(shù)據(jù)庫中獲取人ARG基因共232個，limma包以FDR<0.05和|logFC|>1為條件篩選出RNA-seq數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的ARG。ClusterProfiler、Org.Hs.eg.db、Enrichplot和Ggplot2包行基因本體論(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，以p.adjust和qvalue均<0.05為條件發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)ARG的主要生物學(xué)特征。

1.3 預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)ARG的篩選 結(jié)合OSCC中差異表達(dá)ARG和預(yù)后數(shù)據(jù)，Survival包行單因素Cox分析后將P<0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)一步應(yīng)用Glmnet包納入Lasso回歸分析，以達(dá)到簡化模型參數(shù)的目的。后再次通過Survival包對以上結(jié)果行多因素Cox分析篩選出預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)ARG。

1.5 Western-blot驗證模型中基因在OSCC中的表達(dá) 因既往研究尚未闡明模型中BAK1在OSCC中的表達(dá)情況，故應(yīng)用Western-blot檢測BAK1蛋白在OSCC中的表達(dá)。收集2021年7月—2022年1月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔頜面外科行手術(shù)治療的OSCC患者17例的癌組織及相應(yīng)癌旁組織樣本(距腫瘤邊緣>2.0 cm)，且術(shù)后病理證實為OSCC和正常組織。所有患者術(shù)前均未接受任何腫瘤相關(guān)治療。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批(2020KY283)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

RIPA裂解液(碧云天公司)提取組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5% 脫脂奶粉的封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。PVDF膜浸泡于一抗(BAK1，1∶2 000；β-actin，1∶5 000，Affinity公司)孵育液中，4℃ 孵育過夜。洗去多余一抗，PVDF膜浸泡于HRP標(biāo)記二抗(1∶50 000，武漢博士德生物工程有限公司)孵育液中，37℃搖床孵育2 h。洗去多余二抗，顯色曝光。使用BandScan分析膠片灰度值，根據(jù)目標(biāo)蛋白和內(nèi)參條帶的灰度值之比計算相對表達(dá)量。結(jié)果應(yīng)用Graph Prism軟件行t檢驗分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OSCC中差異表達(dá)ARG的篩選 在RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選出EIF4EBP1、BAK1、RGS19、HIF1A、CTSL、VMP1、SPNS1、TNFSF10、TP63、BID、VEGFA、SPHK1、EGFR、SERPINA1、DDIT3、EIF2AK2、ITGB4、ITGA3、APOL1、IRGM、BIRC5、FADD、ITGA6、IFNG、NRG1、IL24、CDKN2A等27個上調(diào)ARG和NRG2、NRG3、MAP1LC3C、PRKN、HSPB8、CCL2、FOS、TP53INP2、PTK6、NKX2-3等10個下調(diào)ARG(FDR<0.05，|logFC|>1)(圖1A、B)。箱線圖可視化了上述基因在OSCC和癌旁樣本中的表達(dá)(圖1C)。

注：A、C.37個差異表達(dá)ARG的表達(dá)情況；B.差異表達(dá)ARG的篩選，紅色為上調(diào)，綠色為下調(diào)，黑色為無差異

2.2 差異表達(dá)ARG的富集分析 差異表達(dá)ARG的GO富集分析表明，主要涉及自噬相關(guān)機制的生物學(xué)過程(圖2A)。KEGG富集分析表明，主要涉及細(xì)胞凋亡及人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)和人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染等途徑(圖2B)。

注：A.GO富集分析前5位；B.KEGG富集分析前10位

2.3 預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)ARG的篩選與風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建 合并OSCC中差異表達(dá)ARG和預(yù)后數(shù)據(jù)后行單因素Cox分析獲得6個符合P<0.05的ARG，包括FADD、NKX2-3、ITGA6、CTSL、BAK1、ITGA3(圖3A)。進(jìn)一步通過Lasso回歸分析(圖3B、C)及多因素Cox分析(圖3D)篩選出FADD、NKX2-3、BAK1作為預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)ARG，用于風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建。即RS =(1.558 5×FADD)+(-0.557 8×NKX2-3)+(1.547 1×BAK1)。

注：A.單因素Cox分析確定6個P<0.05的ARG；B、C.Lasso回歸分析選擇最佳參數(shù)；D.多因素Cox分析確定3個預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)的ARG

2.4 風(fēng)險預(yù)測模型的分析 基于TCGA的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，以RS中位數(shù)分布的高、低風(fēng)險組，見圖4A，組內(nèi)患者的生存狀況及模型內(nèi)3個預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)ARG的表達(dá)情況，見圖4B、D。Kaplan-Meier生存分析表明，高風(fēng)險組的5年生存率低于低風(fēng)險組(P<0.001)(圖4C)。單因素Cox分析表明，RS與患者的預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.001)(圖4E)；多因素Cox分析表明，RS可作為OSCC患者的獨立預(yù)后指標(biāo)(P<0.001)(圖4F)；ROC曲線表明，與包括性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤分期和T分期在內(nèi)的傳統(tǒng)臨床病理特征相比，該預(yù)測模型具有較高的診斷優(yōu)勢(AUC=0.614)(圖4G)。

注：A.基于RS中位數(shù)的高、低風(fēng)險分組；B.組內(nèi)患者的生存狀況；C.高、低風(fēng)險組的Kaplan-Meier生存分析；D.模型內(nèi)ARG表達(dá)情況；E.模型的單因素Cox分析；F.模型的多因素Cox分析；G.模型的ROC曲線分析

2.5 風(fēng)險預(yù)測模型的臨床效用 模型與臨床病理特征間的相關(guān)性分析表明，僅在較高T分期(圖5A)和較大年齡(圖5B)患者中可發(fā)現(xiàn)模型的RS顯著增高(P<0.05)。

注：A.模型與T分期的相關(guān)性；B.模型與年齡的相關(guān)性

2.6 Western-blot驗證OSCC中BAK1蛋白的表達(dá) Western-blot檢測結(jié)果顯示，在OSCC癌組織中BAK1蛋白的表達(dá)高于癌旁組織(t=3.197，P=0.033)，見圖6。

圖6 Western-blot 檢測BAK1蛋白在OSCC中的表達(dá)

3 討 論

自噬在腫瘤形成和癌癥治療中起著復(fù)雜且矛盾的作用，在腫瘤發(fā)生的早期自噬可通過促進(jìn)腫瘤壞死以抑制腫瘤生長，而隨著腫瘤繼續(xù)發(fā)展自噬卻可通過促進(jìn)血管形成或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等加速腫瘤進(jìn)展[5-6]。盡管目前已發(fā)現(xiàn)部分ARG與OSCC的進(jìn)展相關(guān)，但仍缺乏對ARG中潛在預(yù)后或臨床意義的闡明。本研究將TCGA數(shù)據(jù)庫中的OSCC轉(zhuǎn)錄信息和人ARG列表進(jìn)行分析，獲得了在OSCC中差異表達(dá)的ARG共37個。既往研究表明，自噬抑制后增加的FOXO3a可刺激促凋亡基因BBC3/PUMA的轉(zhuǎn)錄[7]；HCMV可通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、遷移及腫瘤侵襲性和血管生成等參與疾病發(fā)展[8]；而HPV與頭頸部鱗癌(HNSCC)之間存在明顯的聯(lián)系，約有26%的HNSCC對HPV呈陽性，其中HPV16為最常檢測到的類型[9]。這與本研究對37個差異表達(dá)ARG的富集分析結(jié)果相類似，在OSCC中差異表達(dá)的ARG多涉及自噬相關(guān)機制，以及多與細(xì)胞凋亡、HCMV感染和HPV感染等途徑相關(guān)。進(jìn)一步將上述ARG表達(dá)數(shù)據(jù)與預(yù)后數(shù)據(jù)相結(jié)合，構(gòu)建出包含F(xiàn)ADD、NKX2-3、BAK1的風(fēng)險預(yù)測模型。Kaplan-Meier生存分析、單因素和多因素Cox分析及ROC曲線結(jié)果表明，該模型具有較準(zhǔn)確的生存預(yù)測性，與傳統(tǒng)臨床特征相比該模型還具有較高的預(yù)測優(yōu)勢，以及在T分期和年齡中可表現(xiàn)出臨床效用。可見該模型內(nèi)的FADD、NKX2-3、BAK1可能成為OSCC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)。

BAK1可誘導(dǎo)線粒體外膜通透化以釋放凋亡因子從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡，這是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵步驟[10]。但查閱既往文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)OSCC中BAK1的相關(guān)研究，因此本研究通過Western-blot檢測了BAK1蛋白在OSCC中的表達(dá)，試驗結(jié)果同數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，驗證了BAK1在OSCC中呈高表達(dá)。FADD位于人11q13.3號染色體，而11q13.3染色體常被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中擴(kuò)增[11-12]。本研究的數(shù)據(jù)分析推測表達(dá)上調(diào)的FADD可能是OSCC的促進(jìn)因素，這種推測在以往的研究中均得到了證實[12-14]，其表明了FADD在OSCC中呈高表達(dá)，特別是在免疫組化蛋白中過表達(dá)，并且與較高的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，或可作為有效的預(yù)后指標(biāo)之一。NKX2-3作為模型中唯一的保護(hù)因素，可激活負(fù)責(zé)細(xì)胞分化、遷移和成熟等信號傳導(dǎo)途徑[15]。NKX2-3在口腔、咽腔、鰓弓外胚層和下頜骨的牙源性上皮中表達(dá)，其主要作用是在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)MAdCAM-1，而MAdCAM-1可通過結(jié)合整合素47和L-選擇素在淋巴細(xì)胞歸巢至黏膜組織中起關(guān)鍵作用[16]。有研究表明，NKX2-3可抑制MAPK通路來抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的生長[17]。本研究的數(shù)據(jù)分析推測高表達(dá)的NKX2-3可能是OSCC進(jìn)展的抑制因素，但目前僅有研究通過qRT-PCR和免疫組化驗證了其在OSCC中呈低表達(dá)[18]，具體作用機制尚待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中OSCC相關(guān)的ARG轉(zhuǎn)錄信息及臨床病理特征和預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出FADD、NKX2-3、BAK1等3個與預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)ARG，構(gòu)建的風(fēng)險預(yù)測模型可有效評估OSCC患者的預(yù)后。雖研究尚存在如模型需在其他隊列中進(jìn)行驗證及需實驗闡明具體調(diào)控機制等局限性，但本研究的數(shù)據(jù)可為未來臨床中對不同風(fēng)險的OSCC患者實現(xiàn)個體化診療提供新的思路。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王錦航：實施研究過程，分析試驗數(shù)據(jù)，論文撰寫；彭士雄：分析試驗數(shù)據(jù)，論文撰寫；趙建廣：資料搜集整理，分析試驗數(shù)據(jù)；陳彥平：提出研究思路，論文修改；崔子峰：設(shè)計研究方案，論文審核