劉漢屈，張燕芳，張帆，孔娜，王建剛

胃癌是臨床常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，至2019年我國(guó)胃癌發(fā)病率已達(dá)43.1/10萬(wàn)左右[1]?；熆捎行а娱L(zhǎng)晚期胃癌患者生存期，但整體預(yù)后依然不理想，化療耐藥是化療失敗的主要原因[2]。微小RNA(miRNA，miR)在腫瘤增殖、侵襲、耐藥等多種生物學(xué)過(guò)程起著重要調(diào)控作用[3]。miR-124-3p、miR-361-5p在肺腺癌、胃癌病情進(jìn)展中的作用已有報(bào)道，但研究多集中于體外研究或動(dòng)物學(xué)研究[4-5]，而在臨床中的研究較少，且關(guān)于二者在胃癌患者外周血循環(huán)中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)是細(xì)胞自噬及耐藥的關(guān)鍵通路[6-7]。本研究旨在探討血清miR-124-3p、miR-361-5p與晚期胃癌患者臨床病理特征、化療敏感性及PI3K/AKT/mTOR通路的關(guān)系，為晚期胃癌的治療提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年3月—2022年2月云南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科收治的晚期胃癌患者90例為研究組，男48例，女42例，年齡48～73(61.30±7.61)歲；合并癥：高血壓13例，高脂血癥7例，糖尿病10例；不良習(xí)慣：吸煙史18例，飲酒史13例，喜腌制食品67例，喜辛辣食品47例，不進(jìn)早餐40例；家族史：胃癌家族史14例，慢性萎縮性胃炎家族史15例；體力狀況ECOG評(píng)分0～1分58例，2分32例；TNM分期：ⅢB期28例，Ⅳ期62例。另選取同期醫(yī)院健康體檢者45例為健康對(duì)照組，男24例，女21例，年齡50～72(60.71±6.85)歲；不良習(xí)慣：吸煙史8例，飲酒史6例，喜腌制食品20例，喜辛辣食品15例，不進(jìn)早餐13例；家族史：胃癌家族史1例，慢性萎縮性胃炎家族史2例。2組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、不進(jìn)早餐習(xí)慣占比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組患者喜腌制食品、喜辛辣食品、胃癌家族史、慢性萎縮性胃炎家族史占比高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2019)醫(yī)倫審第12號(hào)]，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～85歲；②符合晚期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)明確診斷，TNM分期ⅢB～Ⅳ期；③不符合手術(shù)切除指征者，或既往手術(shù)治療術(shù)后化療結(jié)束1年以上復(fù)發(fā)或單一遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④既往未接受含紫杉醇方案化療者；⑤卡氏評(píng)分>60分，ECOG評(píng)分≤2分；⑥有影像學(xué)測(cè)量病灶。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者；②已出現(xiàn)腹膜、皮膚等廣泛性轉(zhuǎn)移者；③預(yù)計(jì)生存期不足3個(gè)月；④合并機(jī)體重要器官功能障礙者；⑤完全性腸梗阻者；⑥精神病史或交流障礙無(wú)法配合資料收集者。

1.3 治療方法 研究組患者入組完善各項(xiàng)檢查和采血后，接受紫杉醇+鉑類(lèi)/5-氟尿嘧啶方案化療，具體方案：多西紫杉醇(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司)第1天給予75 mg/m2靜脈滴注，或紫杉醇(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)第1天給予135 mg/m2靜脈滴注；聯(lián)合注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)20～25 mg/m2靜脈滴注，第1～3天，或氟尿嘧啶注射液(廣東嶺南制藥有限公司)600 mg/m2靜脈滴注，第1～5天。21 d為1個(gè)化療周期。所有患者化療至不能耐受藥物不良反應(yīng)或疾病進(jìn)展。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路mRNA表達(dá)檢測(cè)：治療前用含EDTA真空抗凝管和不含EDTA的真空管采集研究組和健康對(duì)照組受試者的空腹肘靜脈血4 ml 2份，不含抗凝劑的血樣離心后獲得血清樣本，-80℃保存待測(cè)，用于檢測(cè)miR-124-3p、miR-361-5p mRNA表達(dá)水平；含抗凝劑的血樣混勻后-80℃保存全血，用于檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平。采用DNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)獲得血清及全血中的基因組DNA，Trizol法提取總RNA，離心取上清液進(jìn)行純度測(cè)定，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)鏈cDNA，并以之為模板鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)，按照試劑盒設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性45 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min。以U6為內(nèi)參基因，2-△△CT計(jì)算miR-124-3p、miR-361-5p的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT計(jì)算PI3K、AKT、mTOR的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路mRNA引物序列

1.4.2 化療敏感性評(píng)價(jià)：化療2個(gè)周期后采用《實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1(RECIST 1.1)》評(píng)估近期療效。所有目標(biāo)病灶完全消失為完全緩解(CR)，所有可測(cè)量目標(biāo)病灶長(zhǎng)徑總和縮小≥30%為部分緩解(PR)，所有可測(cè)量目標(biāo)病灶長(zhǎng)徑總和增加≥20%為疾病進(jìn)展(PD)，所有可測(cè)量目標(biāo)病灶長(zhǎng)徑總和變化在PR和PD之間為疾病穩(wěn)定(SD)；CR與PR患者記為化療敏感亞組，SD與PD患者記為化療抵抗亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)水平比較 研究組血清miR-124-3p、miR-361-5p相對(duì)表達(dá)量低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 健康對(duì)照組與研究組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)水平比較

2.2 不同化療敏感程度亞組患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)水平比較 90例晚期胃癌患者均完成2個(gè)周期以上化療，其中CR 2例，PR 32例，SD 38例，PD 18例，化療敏感34例(37.78%)，化療抵抗56例(62.22%)。化療敏感亞組血清miR-124-3p、miR-361-5p相對(duì)表達(dá)量高于化療抵抗亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 化療敏感亞組和化療抵抗亞組血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)水平比較

2.3 不同化療敏感程度亞組患者外周血PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路mRNA表達(dá)比較 化療敏感亞組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量低于化療抵抗亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 化療敏感亞組和化療抵抗亞組外周血PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量水平比較

2.4 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同臨床/病理特征中比較 不同性別、年齡、ECOG評(píng)分、病理類(lèi)型、腫瘤位置的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低分化患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于中分化和高分化患者，且中分化患者血清miR-124-3p水平低于高分化患者(P<0.05)，而中分化與高分化患者血清miR-361-5p水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TNM分期Ⅳ期患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于ⅢB期患者(P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同臨床病理特征中比較

2.5 血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)性分析 研究組化療前血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)性分析

3 討 論

多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已是中晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[9-10]。含紫杉醇化療方案是晚期胃癌或胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的主要治療手段，臨床療效顯著，且不良反應(yīng)相對(duì)較少[11-12]。紫杉醇屬于天然抗癌藥，其抗腫瘤機(jī)制通過(guò)與微管蛋白或微管蛋白二聚體作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞有絲分裂周期停滯，從而阻止癌細(xì)胞無(wú)限增殖過(guò)程，但胃癌對(duì)紫杉醇耐藥頻發(fā)是晚期胃癌治療失敗的重要因素，尋找胃癌細(xì)胞藥物敏感的分子生物學(xué)靶標(biāo)有重要臨床意義[13-14]。微小RNA一直是惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多研究顯示[15-17]，非編碼區(qū)單鏈小分子RNA通過(guò)與編碼區(qū)靶基因的3’-UTR區(qū)域在轉(zhuǎn)錄水平上特異性結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與有絲分裂、凋亡、耐藥等過(guò)程。miRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致靶基因功能異常，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的吸收、代謝等過(guò)程造成影響，進(jìn)而影響化療藥物敏感性[18]。

miR-124-3p定位于5q31.1，在多種惡性腫瘤的發(fā)生和其他相關(guān)疾病中具有潛在作用[19-20]。劉利平等[21]研究顯示，卵巢癌患者血清miR-124-3p異常低表達(dá)，且與腫瘤分級(jí)、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是卵巢癌預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在指標(biāo)。miR-361-5p屬于miR-361家族成員之一，定位于X染色體q21.2外顯子，已有研究顯示其在卵巢癌、乳腺癌組織中低表達(dá)[22-23]，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果也可以看出，晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)可能參與胃癌惡性進(jìn)展，其表達(dá)水平與分化程度、TNM分期等病理特征有關(guān)。本研究中化療敏感者血清miR-124-3p、miR-361-5p表達(dá)水平更高，說(shuō)明二者表達(dá)水平與晚期胃癌化療敏感性有關(guān)。細(xì)胞學(xué)研究顯示[24]，miR-124-3p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)后可通過(guò)調(diào)節(jié)E-box同源框1(ZEB1)表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。Hu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p在乳腺癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，細(xì)胞水平上過(guò)表達(dá)miR-124-3p后可顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。Cai等[26]研究提示，miR-124-3p在細(xì)胞水平可以克服肺腺癌細(xì)胞對(duì)培美曲塞的耐藥性。上述研究提示，miR-124-3p與惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性有關(guān)。Zheng等[27]研究顯示，miR-361-5p/Toll樣受體4信號(hào)通路可影響三陰乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。臨床研究顯示[28]，雄激素可調(diào)控miR-361-5p表達(dá)參與去勢(shì)抵抗性前列腺癌對(duì)雄激素靶向治療的耐藥過(guò)程。以上研究提示，miR-361-5p表達(dá)可能是癌細(xì)胞化療敏感性的重要調(diào)控基因。

自噬是真核細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，同時(shí)具有雙重調(diào)控作用，PI3K/AKT/mTOR通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控自噬水平的關(guān)鍵通路，已成為腫瘤化療耐藥機(jī)制研究的熱點(diǎn)[29-30]。Gu等[31]研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路可通過(guò)調(diào)控胃癌細(xì)胞自噬水平，提高胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。新近研究顯示[32]，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中較高水平的突變基因數(shù)量可作為胃腺癌免疫治療效果的預(yù)測(cè)因子，提示使用該通路抑制劑有助于提高胃腺癌治療效果。上述研究說(shuō)明，PI3K/AKT/mTOR參與調(diào)控自噬過(guò)程可能是影響胃癌細(xì)胞紫杉醇化療敏感性降低的決定因素。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p與PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-124-3p、miR-361-5p可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路而參與胃癌對(duì)含紫杉醇方案化療敏感性的調(diào)控。研究證實(shí)，miR-124-3p可通過(guò)與編碼區(qū)基因相互作用抑制PI3K/AKT/mTOR的激活，從而發(fā)揮抗鼻咽癌作用[33]；Jin等[34]發(fā)現(xiàn)miR-361-5p在有順鉑抗性的胃癌細(xì)胞系MGC803/DDP中的表達(dá)較MGC803細(xì)胞系顯著下調(diào)，提示miR-361-5p可能參與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥的調(diào)控。由此可推測(cè)在胃癌中的調(diào)控機(jī)制可能為：miR-124-3p、miR-361-5p通過(guò)與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的靶基因的3’-UTR片段特異性結(jié)合從而抑制該信號(hào)通路的激活，通過(guò)抑制自噬來(lái)抑制胃癌的化療抗性，而發(fā)生化療抵抗的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p處于低表達(dá)狀態(tài)，對(duì)自噬通路抑制效果不足從而導(dǎo)致化療耐藥發(fā)生[35]。

綜上所述，血清miR-124-3p、miR-361-5p與晚期胃癌分化程度、TNM分期及化療敏感性有關(guān)，而且二者的低表達(dá)水平可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路而降低胃癌對(duì)紫杉醇化療的敏感性，為臨床晚期胃癌患者選擇合理化療方案提供參考依據(jù)。但miR-124-3p、miR-361-5p在胃癌中的分子生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)行深入探討，在進(jìn)一步研究中會(huì)針對(duì)治療前后血清miR-124-3p、miR-361-5p水平的變化與化療敏感性及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)性進(jìn)行深入分析，為臨床研究提供更多理論支持。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉漢屈：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)，資料搜集整理，論文修改；張燕芳：提出研究思路，論文審核；張帆、孔娜、王建剛：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析