丁華,郭浩,陳杉,王淼,龍芬,陳坤,冉瑞智
肺癌是一種全球發(fā)病率、病死率均較高的惡性腫瘤,起源于支氣管、氣管組織,其中約85%病例為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)[1]。多數(shù)患者初診時(shí)已為Ⅱ~Ⅲ期,5年生存率為13%~60%,而對(duì)晚期NSCLC患者積極給予綜合治療可以提高5%~10%的生存率[2-3]。硒為人體所需的微量元素,具有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)智力發(fā)育、保護(hù)呼吸系統(tǒng)等功效[4]。亞硒酸鈉(sodium selenite,Na2SeO3)為臨床常用含硒藥物,可增高胃癌細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、破壞線粒體功能等,從而抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡[5-6]。Na2SeO3還可以通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激,促進(jìn)順鉑(cisplatin,CIS)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡[7]。但是Na2SeO3對(duì)CIS誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的影響,其機(jī)制是否涉及氧化應(yīng)激均不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)采用Na2SeO3和/或CIS處理NSCLC細(xì)胞,在體外探究Na2SeO3對(duì)CIS誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的影響,報(bào)道如下。
1.1 材料 (1)細(xì)胞:人NSCLC細(xì)胞株A549,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。(2)試藥試劑:CIS(純度≥98%)、Na2SeO3(純度≥99%)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;F-12K培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;ROS(DCFH-DA探針)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;CCK-8、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;羊抗兔IgG抗體、兔源cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、GAPDH、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9、MMP-3抗體、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。(3)儀器設(shè)備:DM2500熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;Attune NxTTM流式細(xì)胞儀、MultiskanTMFC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;Mini-Protean電泳槽、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜儀器購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2021年7月—2022年3月于恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院硒實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將A549細(xì)胞于室溫下融化后接種至T 25培養(yǎng)瓶中,用含1%青-鏈雙抗、10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每2 d換液1次。
1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法
1.3.1 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞活力:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。(1)不同濃度(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)CIS或不同濃度(0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 nmol/L)Na2SeO3處理A549細(xì)胞48 h,向每孔加入CCK-8試劑10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后于酶標(biāo)儀讀取每孔A549細(xì)胞的吸光度值(A)。(2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,分為對(duì)照(control,C)組(常規(guī)培養(yǎng)48 h)、CIS組(加入CIS 12 μmol/L培養(yǎng)48 h)、Na2SeO3組(加入Na2SeO3110 nmol/L培養(yǎng)48 h)、CIS+Na2SeO3組(先加入Na2SeO3110 nmol/L培養(yǎng)24 h,隨后加入CIS 12 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h),各組A549細(xì)胞按照不同給藥劑量進(jìn)行處理、培養(yǎng)后,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。A549細(xì)胞活力(%)=(A藥物-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。
1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡:離心收集各組A549細(xì)胞(1×105個(gè)),加入Binding緩沖液100 μl重懸,再順次加入Annexin V-FITC染液、PI染液各5 μl并混勻,4 ℃避光孵育30 min,最后加入Binding緩沖液400 μl混勻,上流式細(xì)胞儀檢測(cè),用FlowJo軟件分析A549細(xì)胞凋亡率,其中Annexin V-FITC+/PI+為凋亡細(xì)胞(右上象限)。
1.3.3 Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá):離心收集各組A549細(xì)胞(1×106個(gè)),加入裂解液,冰上裂解30 min提取總蛋白,用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)20 g,再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入封閉液(5%脫脂牛奶)孵育1 h,加入一抗cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、MMP9、MMP3、GAPDH抗體(英國(guó)Abcam公司,1∶1 000)4℃孵育過夜,洗膜。加入羊抗兔IgG(1∶2 000)常溫孵育1 h,洗膜。滴加化學(xué)發(fā)光劑,在暗室中曝光拍照并半定量分析。
1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的遷移和侵襲:(1)遷移實(shí)驗(yàn)。離心收集各組A549細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基重懸。取1×104個(gè)A549細(xì)胞加入Transwell小室上部,取含血清培養(yǎng)基200 μl加入小室下部,培養(yǎng)48 h。小室沖洗后,浸在4%多聚甲醛中35 min,風(fēng)干后浸在結(jié)晶紫中40 min,顯微鏡下拍照。(2)侵襲實(shí)驗(yàn)。在小室上部加入Matrigel膠過夜,凝固后再加入細(xì)胞,其余同遷移實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)遷移和侵襲的A549細(xì)胞個(gè)數(shù)。
1.3.5 細(xì)胞MDA、ROS、4-HNE、GSH-Px水平測(cè)定:離心收集各組A549細(xì)胞,冰上裂解,收集上清,用MDA、4-HNE、GSH-Px試劑盒測(cè)定各指標(biāo)水平。另外,在CIS和/或Na2SeO3處理A549細(xì)胞48 h后,換為無血清培養(yǎng)基(含DCFH-DA 10 mol/L),培養(yǎng)20 min后離心收集細(xì)胞,用上樣緩沖液重懸,流式細(xì)胞儀測(cè)定ROS水平。
2.1 順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 分別用CIS 0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmoL/L處理A549細(xì)胞48 h后,在CIS 1.25~80 μmoL/L時(shí)A549細(xì)胞增殖活性顯著下降,見圖1。經(jīng)計(jì)算CIS的IC50為12.02 μmol/L,采用12 μmol/L CIS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注:與0 μmoL/L CIS比較,aP<0.05
2.2 亞硒酸鈉對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 采用Na2SeO30、6.25、12.5、25、50、100、200、400 nmol/L處理A549細(xì)胞48 h,在Na2SeO312.5~400 nmoL/L時(shí)A549細(xì)胞增殖活性顯著下降,見圖2。經(jīng)計(jì)算Na2SeO3的IC50為110.20 nmol/L,采用110 nmol/L Na2SeO3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注:與0 nmol/L Na2SeO3比較,aP<0.05
2.3 亞硒酸鈉增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制 與C組A549細(xì)胞活力(100.00±2.05)%比較,CIS組(50.49±7.36)%、Na2SeO3組(49.85±6.52)%降低(F/P=147.876/<0.001);與CIS組比較,CIS+Na2SeO3組(29.47±3.61)%A549細(xì)胞活力降低(t/P=9.340/<0.001);而CIS組、Na2SeO3組A549細(xì)胞活力比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.4 亞硒酸鈉增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡 與C組比較,CIS組、Na2SeO3組A549細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平均顯著升高(F/P=15.625/<0.001、8.131/0.004、22.371/<0.001);與CIS組比較,CIS+Na2SeO3組A549細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平升高(t/P=10.911/<0.001、9.098/<0.001、10.809/<0.001);而CIS組、Na2SeO3組細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。
表1 4組A549細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平比較
2.5 亞硒酸鈉增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的抑制 與C組比較,CIS組、Na2SeO3組A549細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)、侵襲個(gè)數(shù)及MMP-9、MMP-3蛋白水平顯著降低(F/P=78.926/<0.001、43.071/<0.001、36.862/<0.001、75.431/<0.001);與CIS組比較,CIS+Na2SeO3組A549細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)、侵襲個(gè)數(shù)及MMP-9、MMP-3蛋白水平均顯著降低(t/P=9.573/<0.001、9.746/<0.001、6.788/0.001、9.481/<0.001);而CIS組、Na2SeO3組A549細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)、侵襲個(gè)數(shù)及MMP-9、MMP-3蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3、圖4、表2。
表2 4組A549細(xì)胞遷移、侵襲個(gè)數(shù)及MMP-9、MMP-3蛋白水平比較
圖3 各組A549細(xì)胞遷移、侵襲情況
圖4 Western-blot檢測(cè)各組A549細(xì)胞MMP-9、MMP-3蛋白表達(dá)
2.6 亞硒酸鈉增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞氧化損傷 與C組比較,CIS組、Na2SeO3組A549細(xì)胞中ROS、MDA、4-HNE水平顯著升高(F/P=45.779/<0.001、5.216/0.019、25.084/<0.001);與CIS組比較,CIS+Na2SeO3組A549細(xì)胞中ROS、MDA、4-HNE水平升高(t/P=6.069/0.002、9.218/<0.001、15.945/<0.001);而CIS組、Na2SeO3組ROS、MDA、4-HNE水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);4組間GSH-Px活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表3。
表3 4組A549細(xì)胞ROS、MDA、4-HNE水平及GSH-Px活性比較
圖5 各組A549細(xì)胞ROS熒光比較
肺癌在中國(guó)惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率均居首位,雖然診療技術(shù)不斷提升,肺癌患者的整體5年生存率仍不理想[8],仍有必要尋找肺癌治療的新策略。我國(guó)肺癌患者的病理類型以NSCLC為主,因此本研究采用NSCLC細(xì)胞進(jìn)行研究。硒為維持多種生理過程所必需的微量元素,其攝入量與前列腺癌、胃癌等腫瘤的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān),提示硒具有預(yù)防癌癥的特性[9-11]。本研究觀察到Na2SeO3可以增強(qiáng)CIS對(duì)A549細(xì)胞的抑增殖作用,且Na2SeO3可以促進(jìn)CIS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。Doello等[12]發(fā)現(xiàn),Na2SeO3單獨(dú)或聯(lián)合吉西他濱可以有效降低胰腺癌細(xì)胞遷移和菌落形成能力,減少癌癥干細(xì)胞球的形成,與本研究結(jié)果相似。而Na2SeO3對(duì)A549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用可能通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因進(jìn)行干預(yù),觸發(fā)caspase-3、caspase-9等一系列半胱氨酸酶的激活,從而促進(jìn)凋亡[13]。既往研究多集中在Na2SeO3的抗凋亡作用,本研究還觀察到,Na2SeO3可以抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲,并增強(qiáng)CIS對(duì)A549細(xì)胞的抑遷移、抑侵襲作用。
硒在最佳劑量下具有抗氧化活性,而在超營(yíng)養(yǎng)劑量下表現(xiàn)出促氧化活性[14]。超量的硒可劫持細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)(谷胱甘肽系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng))以產(chǎn)生ROS,從而發(fā)揮抗癌作用[15-16]。Na2SeO3具有很強(qiáng)的氧化硫醇能力,為最有效的抑癌硒化合物之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn),Na2SeO3可以在不改變GSH-Px活性的前提下,加劇CIS誘導(dǎo)A549細(xì)胞的ROS釋放和氧化損傷。Na2SeO3能夠通過亞硒酸鹽—三硫化硒—還原的過硫化硒—硒陰離子(selenide anions,HSe-)多個(gè)步驟轉(zhuǎn)化為HSe-,在癌細(xì)胞內(nèi)大量積聚,進(jìn)一步與氧氣進(jìn)行氧化還原循環(huán)釋放大量ROS,造成癌細(xì)胞損傷[18-19]。Wu等[20]研究表明,腹腔注射Na2SeO3可有效抑制肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠腹膜癌,這與本結(jié)果相似。Wu等[20]指出,Na2SeO3能促進(jìn)癌細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,這與硒在癌細(xì)胞中的選擇性累積和ROS的大量產(chǎn)生直接相關(guān),然而Na2SeO3的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。
綜上所述,Na2SeO3可加強(qiáng)CIS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡,抑制其增殖、遷移、侵襲,其機(jī)制可能與促進(jìn)ROS產(chǎn)生有關(guān),但是其在癌細(xì)胞中選擇性積累的機(jī)制并不清楚,尚待后續(xù)研究明確。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻(xiàn)聲明
丁華、陳杉:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;王淼、龍芬:提出研究思路,實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文修改;陳坤:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),資料搜集整理,論文審核;冉瑞智:提出研究思路,課題設(shè)計(jì),論文修改,論文審核