徐婷 陶金 岳鐳

摘 要：為了證明總有機(jī)碳（total organic carbon， TOC）檢測(cè)法可用于中藥材五味子提取設(shè)備的清潔驗(yàn)證。采用淋洗法與擦拭法取樣，并驗(yàn)證TOC檢測(cè)法的線性、精密度與準(zhǔn)確度、檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）、取樣回收率與穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)總有機(jī)碳法用于中成藥清潔驗(yàn)證的效果。結(jié)果表明，五味子濃度（x）在0.024～0.960 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，其與TOC值（y）呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=218.8x-0.033，r2=0.999；精密度與準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不超過(guò)4%；檢測(cè)限（LOD）為3.84μg/L，定量限（LOQ）為11.5 μg/L；采用兩種方式取樣，在低、中、高濃度淋洗法平均取樣回收率分別為63.91%、81.00%、81.11%，擦拭法平均取樣回收率分別為87.50%、83.33%、106.94%；樣品溶液分別在0、4、8、24、28、48 h進(jìn)行TOC檢測(cè)，RSD為5.21%；應(yīng)用于生產(chǎn)中減壓濃縮罐設(shè)備殘留量計(jì)算，結(jié)果符合限度濃度要求。TOC法可用于五味子提取生產(chǎn)清潔驗(yàn)證，可廣泛應(yīng)用于多活性成分的中藥制藥生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：總有機(jī)碳檢測(cè)法，五味子，清潔驗(yàn)證，擦拭法取樣，淋洗法取樣

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.19.038

Application of Total Organic Carbon Method in Cleaning Validation for Extraction of Schisandra chinensis

XU Ting TAO Jin YUE Lei*

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals）

Abstract： To prove that the total organic carbon （TOC） method can be applied in cleaning validation （CV） for extraction of Schisandra chinensis. Sampling by rinsing and swabbing methods the TOC method was verifi ed for linearity， precision and accuracy， limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ）， sampling recovery rate， stability， which was used for evaluating the effectiveness of facilities cleaning of Chinese patent medicine. The Schisandra chinensis extract concentration（x） at a range of 0.024～0.960 mg/L showed good linear relationship to TOC value （y）， of which the linear regression equation was y=218.8x-0.033， r2=0.999. Both the RSDs in accuracy and precision tests were less than 4%. LOD was 3.8 μg/L， LOQ was 11.5 μg/L.Sampling by two methods， the average sampling recoveries of rinsing method at low， medium and high concentrations were 63.91%， 81.00% and 81.11% respectively， and those of swabbing method were 87.50%， 83.33% and 106.94% respectively. The test solutions were detected at 0， 4， 8， 24， 28， and 48 h respectively by TOC method， with RSD of 5.21%. When applied in the production， the residual concentration of vacuum concentration tank residues were lower than allowable level. The TOC method can be used for CV of Schisandra chinensis extract， which means that it can be widely used for CV of traditional Chinese medicine production with complex components.

Keywords： total organic carbon （TOC） method， Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.， cleaning validation， swabbing sampling， rinsing sampling

0 引 言

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”，收錄于2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）[1]與2012年《可用于保健食品的物品名單》[2]中，五味子中目前已知的活性成分達(dá)203種[3-4]，主要成分有五味子醇甲[5]、五味子甲素、五味子乙素等木質(zhì)素類成分[6]，萜類[7]，揮發(fā)油[8]，多糖、黃酮類[9]及有機(jī)酸[10]等。

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（Good Manufacturing Practice，GMP）要求企業(yè)對(duì)制藥設(shè)備進(jìn)行有效清洗以最大限度防止藥品污染和交叉污染[11]，為保證清洗后的設(shè)備中各種殘留物的總量低至不影響共線產(chǎn)品規(guī)定的療效、質(zhì)量和安全性，需要對(duì)設(shè)備進(jìn)行清潔驗(yàn)證[12]，即通過(guò)科學(xué)的方法采集足夠的數(shù)據(jù)，以證實(shí)按規(guī)定方法清潔后的設(shè)備，能始終如一地達(dá)到預(yù)定的清潔標(biāo)準(zhǔn)[13]。

五味子提取后設(shè)備清潔殘留成分多、限度低于目視標(biāo)準(zhǔn)（1～4 μg/cm2），難以界定溶解度最小或顏色最深的目標(biāo)化合物[14]，新興起的總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）法[15]可檢測(cè)到所有含碳化合物，結(jié)果以碳的質(zhì)量濃度表示，包括清潔劑乙醇等都能被檢出，該法檢測(cè)范圍廣，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，更適用于中藥生產(chǎn)過(guò)程清潔驗(yàn)證[16-18]。

1 儀器與材料

GE Sievers M9 型總有機(jī)碳TOC分析儀（美國(guó)通用電氣GE公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多METTLER TOLEDO 儀器上海有限公司）；五味子（批號(hào)J200301，上海真仁堂藥業(yè)有限公司）；蔗糖對(duì)照品（批號(hào)111507-202105，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；1，4對(duì)苯醌對(duì)照品（批號(hào)101197-201904，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制，Millipore A10水純化系統(tǒng)）。

2 方 法

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.2 線性

用超純水溶解60 mg五味子浸膏，并定容至500 mL，配置濃度為120 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液體，再用超純水稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.024、0.060、0.120、0.240、0.480、0.960 mg/L的溶液，以超純水為空白對(duì)照，分別進(jìn)行TOC檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定TOC結(jié)果的平均值（μg/L）作為y值，以五味子質(zhì)量濃度（mg/L）為x值，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r2）。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

將上述質(zhì)量濃度分別為0.24 mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L的樣品溶液再進(jìn)行TOC檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定9次，計(jì)算RSD，9次檢測(cè)結(jié)果的平均值與帶入線性方程所得的TOC響應(yīng)值之比為回收率結(jié)果。

2.4 檢測(cè)限與定量限

在10個(gè)取樣瓶中分別加滿純化水，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值，由t99（n-1）×SD得到檢測(cè)限（Limit of detection， LOD），將檢測(cè)限乘以3，得出定量限（Limit of quantitation， LOQ）[18]。

2.5 取樣回收率

2.5.1 淋洗法回收率

吸取56.00 mg/L的五味子樣品溶液6 mL，定量裝入干凈的噴霧器中，分別從閥門的左右兩側(cè)均勻噴在管內(nèi)壁，內(nèi)表面目視干燥后用700 mL純化水淋洗，在干凈的燒杯中收集淋洗水并檢測(cè)其TOC響應(yīng)值，用扣除背景的TOC響應(yīng)值代入方程換算出樣品溶液濃度（mg/L），并計(jì)算平均濃度（mg/L），除以理論濃度（mg/L）得到淋洗法平均取樣回收率（%），用0.5倍殘留濃度與1.5倍殘留濃度的樣品溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 擦拭法回收率

準(zhǔn)備一塊平整光滑的不銹鋼板，在其表面劃出25 cm2×4的區(qū)域，配置濃度為19.20 mg/L的五味子樣品溶液，定量裝入干凈的噴霧器中，在不銹鋼表面上均勻噴灑10 mL溶液，液體不得越過(guò)邊界，靜置過(guò)夜，自然晾干。取樣人員手部清潔，在目視檢查合格后用分別用兩支TOC專用棉簽進(jìn)行擦拭取樣，取樣面積為25 cm2。取樣前，棉簽使用少量純化水潤(rùn)濕，按圖1（a）的路線用棉簽的一側(cè)擦拭，盡量覆蓋全部取樣面積，取樣時(shí)注意折彎棉簽頭取樣，然后翻轉(zhuǎn)棉簽使其另一面按圖1（b）的路線進(jìn)行擦拭，應(yīng)盡可能采用相同的力度[20]。

將現(xiàn)場(chǎng)取樣擦拭完畢的TOC專用棉簽頭折斷，浸入裝有100 mL純化水的燒杯中，輕搖并放置10 min，使有關(guān)物質(zhì)溶出后測(cè)定，用扣除背景的TOC響應(yīng)值代入線性回歸方程換算出樣品溶液的平均濃度值（mg/L），除以理論濃度（mg/L）得到擦拭法取樣回收率（%），用0.5倍殘留濃度與1.5倍殘留濃度的五味子浸膏溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)并測(cè)定。

2.6 樣品溶液穩(wěn)定性

將質(zhì)量濃度為0.48 mg/L的樣品溶液保存在常溫環(huán)境中，分別在0、4、8、24、28、48 h測(cè)定其TOC響應(yīng)值，平行測(cè)定3次，以其平均值計(jì)算RSD。

2.7 方法在車間的應(yīng)用

3 結(jié) 果

3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)效率（R）為94%，在85%～115%之內(nèi)，符合要求，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

3.2 線性

超純水空白的TOC響應(yīng)值<0.03 μg/L，當(dāng)樣品溶液的濃度（x）在0.024～0.960 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，其與TOC響應(yīng)值（y）呈較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=218.8x-0.033，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

樣品溶液在低、中、高濃度對(duì)應(yīng)的回收率在90%～110%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%、2.9%，2.1%，表明精密度與準(zhǔn)確度好，如表3所示。

3.4 檢測(cè)限與定量限

淋洗水的TOC平均值為0.78 μg/L，SD為1.09μg/L，LOD=SD×t99（n-1）=1.09×3.52=3.84 μg/L，LOQ=3SD×t99（n-1）=11.5 μg/L。

3.5 取樣回收率

3.5.1 淋洗法回收率

0.24 mg/L（0.5倍殘留濃度）、0.48 mg/L（1.0倍殘留濃度）、0.72 mg/L（1.5倍殘留濃度）的淋洗水樣品平均回收率分別為63.91%、81.00%、81.11%，淋洗法取樣回收率均大于60%，見(jiàn)表4。

3.5.2 擦拭法回收率

0.24 mg/L（0.5倍殘留濃度）、0.48 mg/L（1.0倍殘留濃度）、0.72 mg/L（1.5倍殘留濃度）的擦拭樣品溶液平均回收率分別為87.50%、83.33%、106.94%，見(jiàn)表5。

3.6 穩(wěn)定性

放置了48 h的樣品溶液分別在6個(gè)時(shí)間段進(jìn)行TOC檢測(cè)，RSD為5.21%，樣品送檢后應(yīng)在48 h內(nèi)完成檢測(cè)。供試品溶液穩(wěn)定性驗(yàn)證如圖3所示。

3.7 方法在車間的應(yīng)用

分別根據(jù)減壓濃縮罐設(shè)備與干燥設(shè)備清洗后的樣品溶液TOC響應(yīng)值，代入線性公式折算，所得樣品溶液濃度均小于標(biāo)準(zhǔn)限度濃度，說(shuō)明減壓濃縮罐與干燥設(shè)備中五味子浸膏的殘留量符合限度要求。

4 討 論

中藥設(shè)備清潔方法驗(yàn)證是對(duì)生產(chǎn)取樣人員操作、棉簽選擇、溶劑選擇等的全面模擬考察，進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)保證擦拭取樣人員與車間生產(chǎn)取樣人員一致，若無(wú)法保證，可考察不同人員擦拭后的效果，TOC檢測(cè)法應(yīng)使用專用棉簽，避免棉簽影響取樣回收率，擦拭溶劑應(yīng)與取樣溶劑一致，注意擦拭溶劑不應(yīng)干擾TOC檢測(cè)結(jié)果。

取樣方面，對(duì)于易擦拭的設(shè)備表面采用棉簽擦拭法，對(duì)于不易擦拭的表面及衛(wèi)生球閥采用淋洗法，僅在0.24 mg/L的濃度時(shí)，淋洗法取樣平均回收率<70%，其余擦拭法與淋洗法平均回收率在80%～110%范圍內(nèi)，當(dāng)兩種取樣方法均適用時(shí)建議優(yōu)先采用擦拭法，尤其在指標(biāo)成分含量極低時(shí)，擦拭法取樣回收率更好，回收率不符合要求的主要原因包括人員擦拭力度不夠、擦拭路徑未包含全部取樣面積、棉簽與取樣表面的接觸角度過(guò)大導(dǎo)致接觸面積不足等。

在藥品生產(chǎn)設(shè)備清潔過(guò)程中，一般選擇溶解度小、毒性高的指標(biāo)成分進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于不含毒性成分且有效成分殘留含量極低的中藥產(chǎn)品，TOC法凸顯優(yōu)勢(shì)，該法能更全面檢測(cè)中藥品種中多指標(biāo)成分的殘留量，具有很大的應(yīng)用空間。本次驗(yàn)證TOC法檢測(cè)限低至3.8 μg/L，且樣品檢測(cè)耗時(shí)僅10 min，檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高，樣品溶液質(zhì)量濃度與TOC響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2=0.999，檢測(cè)精密度好、準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性考察結(jié)果表明樣品溶液較為穩(wěn)定，可至少放置48 h。但TOC法檢測(cè)也有一定的局限性，其僅能檢測(cè)水溶性物質(zhì)的碳含量，且清洗要求高，檢測(cè)結(jié)果易受殘留物影響。

5 結(jié) 論

以五味子提取設(shè)備清潔為例采用TOC法檢測(cè)中藥生產(chǎn)設(shè)備的清潔殘留濃度，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，更適用于基質(zhì)復(fù)雜、指標(biāo)成分含量低于1 mg/kg的中藥生產(chǎn)設(shè)備清潔驗(yàn)證，通過(guò)建立科學(xué)合理的清潔驗(yàn)證檢驗(yàn)方法，滿足不含毒性成分的中藥產(chǎn)品中低濃度、多指標(biāo)組分的檢測(cè)要求，為中藥制劑生產(chǎn)清潔驗(yàn)證工作提供方法學(xué)研究參考。

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作者簡(jiǎn)介

徐婷，碩士，主要從事中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究。

岳鐳，通信作者，高級(jí)工程師，主要從事中藥生產(chǎn)及質(zhì)量管理研究工作。

（責(zé)任編輯：袁文靜）