劉維超 張 誠 劉宏生 鄒文軍 羅永昶

(中央儲(chǔ)備糧徐州直屬庫有限公司 221116)

自改革開放以來,中國經(jīng)濟(jì)迎來了全面快速發(fā)展,國家對(duì)能源的需求與日俱增,但是嚴(yán)峻的能源短缺和氣候問題阻礙了發(fā)展進(jìn)程。為了平衡經(jīng)濟(jì)發(fā)展、能源短缺和環(huán)境友好關(guān)系等關(guān)鍵問題,中國對(duì)自身發(fā)展提出了新的要求,“雙碳”政策應(yīng)運(yùn)而生。在此背景下,以生物乙醇為代表的新型可替代環(huán)境友好型生物能源逐步進(jìn)入大眾視野[1,2,3]。我國推動(dòng)生物乙醇發(fā)展至今,由于不同糧食品種、營養(yǎng)成分和可利用碳源等差異在實(shí)際工業(yè)乙醇發(fā)酵過程中,帶來乙醇產(chǎn)量波動(dòng)較大等實(shí)際問題,使得以玉米為生產(chǎn)原料的第一代生物燃料乙醇發(fā)酵仍處于主導(dǎo)地位[4]。為了解決這類問題,混合物料發(fā)酵備受關(guān)注[5,6,7]。

不同原料本身的碳元素和氮元素占比各不相同[8],這將會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵醪液呈現(xiàn)不同的碳氮比,勢必影響乙醇發(fā)酵過程。一般情況下,小麥蛋白質(zhì)和碳水化合物含量最高,分別為14%～20%和75.2%[9];玉米本身含碳量與小麥相當(dāng)(75%),但其蛋白質(zhì)含量較低(約9%～10%)[10];與前二者相比,稻谷有著更低的蛋白質(zhì)含量(8%～11%)和碳水化物含量(65%)[11];最后,木薯無論在蛋白質(zhì)含量還是碳水化合物含量的指標(biāo)上均最低,分別低于5%和30%[12]。為此,在采用單一原料時(shí),原料本身的碳氮比將會(huì)是制約發(fā)酵的重要指標(biāo)之一。

本研究將討論通過不同原料配比探究發(fā)酵醪液本身碳氮比與乙醇發(fā)酵過程關(guān)系,尋找糧食燃料乙醇發(fā)酵新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

高溫活性酵母粉[13]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基:麥芽汁固體培養(yǎng)基(麥芽250 g/L磨碎過濾加瓊脂20 g/L,121℃滅菌20 min,備用)[14]。

種子培養(yǎng)基:酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸銨4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L;115℃滅菌20 min,備用[15]。

糧食醪液制備方法:分別取玉米、稻谷、小麥以及木薯1 kg,置于破壁機(jī)打成粉狀,加2.5 L水煮沸備用。

復(fù)合糧食醪液制備方法:按比例分別取玉米、木薯、稻谷和小麥共1 kg,置于破壁機(jī)打成粉狀,加2.5 L水煮沸備用。

單一糧食醪液發(fā)酵培養(yǎng)基:單一糧食醪液200 mL,抗生素(菌肽寶):22 ppm、蛋白酶15 μ/g、淀粉酶100 μ/g、pH 4.8,發(fā)酵溫度30℃。

復(fù)合糧食醪液發(fā)酵培養(yǎng)基:復(fù)合糧食醪液200 mL,抗生素(菌肽寶):22 ppm、蛋白酶15 μ/g、淀粉酶100 μ/g、pH 4.8,發(fā)酵溫度30℃。

1.2.2 培養(yǎng)條件 一級(jí)種子培養(yǎng):用接種環(huán)挑取麥芽汁固體培養(yǎng)基上單菌落酵母細(xì)胞接種于5 mL種子培養(yǎng)基中,30℃,200 rpm培養(yǎng)12 h。

二級(jí)種子培養(yǎng):取1 mL一級(jí)種子液接種于100 mL種子培養(yǎng)基中,30℃,200 rpm培養(yǎng)18 h。

游離細(xì)胞乙醇發(fā)酵:量取20 mL二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入單一糧食醪液發(fā)酵培養(yǎng)基/復(fù)合糧食醪液發(fā)酵培養(yǎng)基中后,再置于30℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分析方法

細(xì)胞數(shù)測定:取2.5 mL混勻樣品放入100 mL容量瓶中,定容后靜置2 min,然后置于血球計(jì)數(shù)板上利用顯微鏡觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)[16]。

殘還原糖糖測定:采用DNS法[17]。

酒度測定:取100 mL發(fā)酵液,加熱蒸餾,定量到100 mL,用酒度計(jì)進(jìn)行測量[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單一物料對(duì)生物乙醇發(fā)酵影響

如圖1所示,在相同發(fā)酵條件下,以不同種類糧食為原料所得的發(fā)酵液具有不同的發(fā)酵能力。以乙醇產(chǎn)量和殘總糖作為評(píng)價(jià)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)以玉米為原料制備的發(fā)酵用醪液最終可得平均酒度12.5 v/v,發(fā)酵最終殘總糖為2.55 g/100 mL,優(yōu)于稻谷(酒度:12 v/v;殘總糖:2.21 g/100 ml)、木薯(酒度:10.9 v/v;殘總糖:1.93 g/100 mL)和小麥(酒度:12.3 v/v;殘總糖:2.52 g/100 mL)。

圖1 不同單一物料對(duì)乙醇發(fā)酵影響

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)乙醇發(fā)酵影響

2.2 釀酒酵母復(fù)合醪液乙醇發(fā)酵能力評(píng)估

為了改善釀酒酵母乙醇發(fā)酵能力,改善乙醇發(fā)酵對(duì)部分糧食的依賴性,提高糧食在乙醇發(fā)酵領(lǐng)域的整體利用率,分別以四種糧食為原料按照一定比例配置的培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了簡便實(shí)驗(yàn),此實(shí)驗(yàn)過程中必須以小麥、玉米、木薯和稻谷四種物料進(jìn)行復(fù)配且復(fù)配比例最少為20%,并且以20%為浮動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)。其中對(duì)照樣本為實(shí)驗(yàn)組1(玉米25%、木薯25%、稻谷25%、小麥25%)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組各物料占比以及C/N

實(shí)驗(yàn)組1作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組,其C/N為8.6,細(xì)胞數(shù)為2.41億/mL,終酒度12.4,實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組5,物料分別提高了稻谷和玉米的占比,但是其C/N并未因此產(chǎn)生較大變動(dòng)。不僅如此,這兩組實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)和酒度均處于同一水平。實(shí)驗(yàn)組2由于增加了小麥的占比導(dǎo)致其C/N下降,而且其發(fā)酵體系細(xì)胞數(shù)明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組(3.61億/mL),但是酒度并未因此獲得改善,相反低于平均水平。實(shí)驗(yàn)組4由于提高了木薯占比,提高了C/N,發(fā)酵體系中細(xì)胞數(shù)較低,但實(shí)驗(yàn)組4酒度(13.1 v/v)產(chǎn)量最高。實(shí)驗(yàn)組5的玉米占比最高,其C/N與實(shí)驗(yàn)組1相似。雖然實(shí)驗(yàn)組5與實(shí)驗(yàn)組4 C/N相差較大,細(xì)胞數(shù)也有著較大的差異,但是此兩組實(shí)驗(yàn)均獲得了最高的酒度。

此外,發(fā)酵液的C/N將會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長過程和發(fā)酵過程。玉米、木薯、稻谷、小麥的含氮量(以蛋白質(zhì)含量計(jì))各不相同,分別為8%～9%(以8.5%計(jì))、2%、8%～13%(以10.5%計(jì))和13.24%。對(duì)比細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn),雖然實(shí)驗(yàn)組1乙醇發(fā)酵得到最高乙醇濃度,但是醪液中的細(xì)胞數(shù)較實(shí)驗(yàn)組4明顯減少,實(shí)驗(yàn)組2明顯增多,所以實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4、5中細(xì)胞數(shù)的多少主要受制于糧食自身的氮源含量。觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組1～5細(xì)胞數(shù)多少與體系中的含氮量正相關(guān)。

2.3 糧食乙醇發(fā)酵過程中C/N與發(fā)酵能力關(guān)系

在利用糧食進(jìn)行乙醇發(fā)酵過程中,乙醇發(fā)酵能力明顯受制于物料種類和物料營養(yǎng)物質(zhì)的占比。物料體系碳源的占比多少制約乙醇產(chǎn)量上限,氮源的占比主要制約樣本體系中細(xì)胞數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組4、實(shí)驗(yàn)組5分別提高了小麥、稻谷、木薯、玉米的占比,使得物料的C/N也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。由圖3可知,體系中的細(xì)胞數(shù)變化和乙醇產(chǎn)能分別與C/N呈現(xiàn)反比例和正比例關(guān)系。在以復(fù)合物料為醪液進(jìn)行乙醇發(fā)酵過程中,小麥的占比提高增加了發(fā)酵體系中酵母細(xì)胞總數(shù),乙醇并未由發(fā)酵體系中細(xì)胞總數(shù)增加而提高,反而是所有實(shí)驗(yàn)組中最低。而木薯占比提高則降低了發(fā)酵體系中的細(xì)胞總量,乙醇產(chǎn)量達(dá)到所有實(shí)驗(yàn)組最大。除了實(shí)驗(yàn)組4以外,實(shí)驗(yàn)組5同樣有著較高的乙醇產(chǎn)量,但是實(shí)驗(yàn)組5有著更高的細(xì)胞總數(shù),發(fā)酵體系也會(huì)更加穩(wěn)定。

圖3 物料C/N與糧食乙醇發(fā)酵細(xì)胞數(shù)和酒度關(guān)系趨勢圖

若單以乙醇產(chǎn)量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),在糧食發(fā)酵過程中,醪液C/N控制在8.5～10.5應(yīng)能達(dá)到最大乙醇產(chǎn)量,這為糧食乙醇發(fā)酵的原料儲(chǔ)備和使用提供了更高靈活性。

3 結(jié)論

3.1 不同單一物料由于C/N比差異影響發(fā)酵體系細(xì)胞總量,其中玉米更適宜工業(yè)乙醇發(fā)酵,木薯和小麥次之,單一木薯發(fā)酵效果最差。

3.2 復(fù)合糧食按照一定比例復(fù)配可以有效改善糧食乙醇發(fā)酵能力。實(shí)驗(yàn)組4和實(shí)驗(yàn)組5較單一物料最高酒度分別提升0.6 v/v和0.5 v/v。

3.3 在糧食乙醇發(fā)酵過程中,體系中的細(xì)胞總量化和乙醇產(chǎn)能分別與C/N呈現(xiàn)反比例和正比例關(guān)系。