孟強(qiáng) 張文杰 吳偉康 牛坤偉 楊龍 張玄 陶開山

近年來，終末期肝病和急性肝衰竭患者數(shù)量與日俱增，肝移植是最有效的治療方法。然而，供者器官短缺嚴(yán)重影響了患者的治療，許多患者在等待移植期間死亡。異種移植是解決器官短缺的有效方法[1-2]。以往研究發(fā)現(xiàn)，敲除豬體內(nèi)主要產(chǎn)生排斥反應(yīng)的基因[3-4]，可以有效緩解超急性排斥反應(yīng)[5]，延長受體的生存期，但目前這種方法還不足以用于臨床治療[6-7]。而當(dāng)體液性排斥反應(yīng)被減弱后，細(xì)胞性排斥反應(yīng)的表現(xiàn)突顯出來。在移植術(shù)后的病理組織學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，異體細(xì)胞主要是自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[8-10]，宿主單核細(xì)胞和NK細(xì)胞是延遲異體移植排斥反應(yīng)的主要媒介，一旦牢牢黏附在異體移植物的血管內(nèi)皮上，就能發(fā)揮其效應(yīng)功能，包括產(chǎn)生促進(jìn)炎癥和血栓形成的介質(zhì)，直接裂解內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)[11-12]。

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-18是IL-1家族的成員，是一種強(qiáng)大的促炎因子，IL-18憑借其促炎活性和多效性在各種疾病中發(fā)揮著重要的病理生理作用[13-15]。在健康人體內(nèi)，IL-18結(jié)合蛋白（binding protein，BP）的血清水平約為IL-18的20倍，與IL-18受體（receptor，R）相比具有非常高的親和力。IL-18BP能阻斷IL-18與IL-18R結(jié)合，中和IL-18的生物活性，從而抑制干擾素（interferon，IFN）-γ的產(chǎn)生，限制NK細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1的反應(yīng)[16-17]。在一些疾病模型中，IL-18BP缺陷的小鼠表現(xiàn)出病情加重，用外源性IL-18 BP治療可有效減輕病理反應(yīng)[18-20]，在治療成人斯蒂爾氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和斑塊狀銀屑病的臨床試驗(yàn)中具有良好的安全性和療效指征。通過調(diào)節(jié)IL-18BP水平來減弱IL-18強(qiáng)大的促炎癥反應(yīng)是緩解炎癥相關(guān)疾病的有效措施[21]。

據(jù)研究報(bào)道，在體外用人血灌注的豬器官和豬到非人靈長類動物（non-human primate，NHP）的異種移植中發(fā)現(xiàn)了NK細(xì)胞的浸潤[10-13]，表明NK細(xì)胞參與了異種移植的排斥反應(yīng)[22-23]。隨后，人們對人NK細(xì)胞在異種移植中的作用機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討IL-18/IL-18BP介導(dǎo)NK-92MI細(xì)胞殺傷α-1, 3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）基因敲除（GTKO）豬內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)以及可能的作用機(jī)制，旨在為下一步大動物異種移植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人NK-92MI細(xì)胞購自美國ATCC。GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞是從豬動脈血管內(nèi)皮中提取的原代細(xì)胞。

主要試劑包括：重組人IL-18（美國BioLegend公司），重組人IL-18BP（武漢ABclonal公司），脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海Beyotime公司），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞殺傷活性試劑盒（美國Promega公司），胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液及MEMα培養(yǎng)基均購于美國Gibco公司，穿孔素（perforin）單克隆抗體、顆粒酶B（granzyme B）單克隆抗體、IFN-γ單克隆抗體均購于英國Abcam公司，B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）單克隆抗體、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved Caspase）-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3 單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購于美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

NK-92MI細(xì)胞在含12.5%馬血清、12.5%胎牛血清、0.2 mol/L肌醇、0.1 mol/L β-巰基乙醇、0.02 mol/L葉酸和青霉素或鏈霉素的MEMα培養(yǎng)基中生長，在37 ℃、5%CO2加濕的空氣中培養(yǎng)。GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞在含有10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，在37 ℃、5% CO2加濕的空氣中培養(yǎng)。

細(xì)胞分組：將NK-92MI細(xì)胞分為NK組、NK+IL-18組、NK+GTKO組、IL-18+NK+GTKO組、IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組。NK細(xì)胞每組5×105個(gè)，GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞每組1×105個(gè)，IL-18和IL-18BP在培養(yǎng)基中濃度分別為100 ng/mL和200 ng/mL，在37 ℃、5% CO2加濕的空氣中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)操作。所有實(shí)驗(yàn)均一式3份。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析炎癥相關(guān)基因表達(dá) 提取各組NK-92MI細(xì)胞的總RNA，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定IFN、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-8、IL-3、IL-6、粒細(xì)胞 -巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達(dá)水平。

1.3.2 NK-92MI細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定 采用LDH細(xì)胞殺傷活性試劑盒測定NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。按照說明進(jìn)行操作，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 根據(jù)試劑盒說明書，用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒評估GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。凋亡的細(xì)胞被染成紅色，細(xì)胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）標(biāo)記為藍(lán)色。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測殺傷效應(yīng)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 分別提取不同處理的NK-92MI細(xì)胞和GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞中的總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉，置于一抗中4 ℃過夜，二抗中室溫孵育90 min，沖洗后按照化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定穿孔素、顆粒酶B、IFN-γ、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism v8.02進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并構(gòu)建圖表。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與NK組比較，NK+IL-18組和NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和 GM-CSF 的mRNA表達(dá)水平只有輕微的升高，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，均為P>0.05）。與NK組、NK+IL-18組以及NK+GTKO組比較，IL-18+NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞中 IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和GM-CSF的mRNA表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，均為P<0.05）。與IL-18+NK+GTKO組比較，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞中 IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和 GM-CSF的mRNA表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，均為P<0.05）。結(jié)果表明IL-18BP能夠抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。

圖1 各組NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)Figure 1 Expression of inflammation-related genes of NK-92MI cells in each group

2.2 IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中具有殺傷效應(yīng)的蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與NK+GTKO組相比，IL-18+NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞中穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ蛋白表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，均為P<0.05）。與IL-18+NK+GTKO組比較，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組穿孔素、顆粒酶B、IFN-γ蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，均為P<0.05）。結(jié)果表明IL-18BP能夠抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中具有殺傷效應(yīng)的蛋白表達(dá)。

圖2 各組NK-92MI細(xì)胞中殺傷效應(yīng)蛋白的表達(dá)Figure 2 Expression of killer effector proteins of NK-92MI cells in each group

2.3 IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞殺傷GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)

LDH試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NK+GTKO組比較，IL-18+NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞對GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A，P<0.05）。與IL-18+NK+GTKO組比較，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組NK-92MI細(xì)胞對GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A，P<0.05）。

TUNEL染色結(jié)果表明，與NK+GTKO組比較，IL-18+NK+GTKO組中陽性細(xì)胞更多，細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B、C，P<0.05）。與IL-18+NK+GTKO組比較，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組中陽性細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B、C，P<0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與NK+GTKO組比較，IL-18+NK+GTKO組GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/ Caspase-3的比例均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D～F，均為P<0.05）。與IL-18+NK+GTKO組比較，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO組Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比例均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D～F，均為P<0.05）。

圖3 各組NK-92MI細(xì)胞對GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)Figure 3 Cytotoxic effect of NK-92MI cells on GTKO porcine endothelial cells in each group

3 討 論

由于我國供者的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要接受肝移植患者的數(shù)量，異種肝移植成為了解決供受體不平衡最有效的手段[24-25]。而異種肝移植術(shù)后急性血管性排斥反應(yīng)仍然是限制供體肝臟存活時(shí)間的重要影響因素[26]。筆者在豬-猴異種肝移植研究中發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞在急性血管性排斥反應(yīng)中起著重要的作用[12]，并且IL-18/IL-18BP比例出現(xiàn)明顯失衡。給予外源性IL-18BP可以起到治療的作用，但如果能使供體肝臟自發(fā)產(chǎn)生IL-18BP將更好地保護(hù)移植肝臟。

當(dāng)受者的血液進(jìn)入供者器官后，免疫細(xì)胞首先接觸到血管內(nèi)皮細(xì)胞并且黏附在上面，進(jìn)而發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后會釋放多種促凝因子富集，形成微血栓，最終導(dǎo)致移植物的失能，因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是減輕排斥反應(yīng)的有效措施。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)IL-18處理后，人NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和GM-CSF的mRNA表達(dá)水平顯著升高，在加入IL-18BP后，上述炎癥因子的表達(dá)明顯被抑制，表明IL-18BP的處理能夠有效抑制NK-92MI細(xì)胞的活化。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，當(dāng)IL-18BP存在時(shí)，NK-92MI細(xì)胞產(chǎn)生的穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ顯著減少，表明IL-18BP能夠抑制IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中具有殺傷效應(yīng)的蛋白表達(dá)。

細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和TUNEL結(jié)果表明，在加入外源性IL-18BP后NK-92MI細(xì)胞對GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯減弱。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的生理作用，主要通過作用于線粒體，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通道導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2均為Bcl-2家族的成員，其中Bax 是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，而Bcl-2是保護(hù)腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[27]。除了Bcl-2家族外，Caspase家族蛋白的活化同樣是細(xì)胞凋亡發(fā)生的特征，其中Caspase-3可激活凋亡信號的傳遞，活化形式的cleaved Capase-3是發(fā)揮功能的亞單位，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。Bax和Bcl-2結(jié)合可形成凋亡二聚體，促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，與Caspase蛋白級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29-30]。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，IL-18激活的NK-92MI細(xì)胞能夠上調(diào)GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/ Caspase-3的比例，而加入IL-18BP后GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比例明顯降低，說明IL-18BP可抑制IL-18激活的NK-92MI細(xì)胞殺傷GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)。

綜上所述，本研究表明IL-18BP可阻斷IL-18誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因表達(dá)和NK-92MI細(xì)胞殺傷GTKO豬內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)。如何在不加入外源性IL-18BP的情況下，維持IL-18BP與IL-18的平衡，減輕異種移植物的免疫排斥反應(yīng)有待進(jìn)一步深入探索研究。