王丹 王巍

南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南京 210000

敗血癥是一種全身感染性疾病，具有高病死率的特點(diǎn)，據(jù)調(diào)查顯示，全球每年約有180萬人患病，其中病死人數(shù)就占30%，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康，因此揭示敗血癥的病理機(jī)制、探索有效的治療方法已經(jīng)迫在眉睫［1］。目前，敗血癥的發(fā)病機(jī)制尚未有明確定論，但隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥是致病菌及其毒素和代謝產(chǎn)物進(jìn)入血流后激活并釋放炎癥介質(zhì)而引起的一系列連鎖反應(yīng)過程，因此如何防止病毒入侵機(jī)體、抑制炎性反應(yīng)是目前臨床工作的重中之重［2］。而固有免疫系統(tǒng)作為機(jī)體防御病原體的第一道防線，研究發(fā)現(xiàn)其不僅在清除病毒方面占有重要地位，還可通過免疫細(xì)胞在敗血癥炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［3］。巨噬細(xì)胞作為一種重要的固有免疫細(xì)胞，近年來越來越多的研究表明，巨噬細(xì)胞焦亡及線粒體功能的改變在敗血癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用，因此其已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及焦點(diǎn)［4］。球狀C1q受體（globular C1q receptor，gC1qR）是一多功能蛋白質(zhì)分子，其表達(dá)于所有哺乳動物細(xì)胞，在調(diào)控病毒感染、先天免疫、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，且前期研究中，我們用RNA測序及生物信息分析的方法在536個差異表達(dá)基因中篩選出gC1qR可能是敗血癥發(fā)生過程中調(diào)控細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子［5］。因此，本文就gC1qR在敗血癥中的表達(dá)及對敗血癥患者巨噬細(xì)胞焦亡和線粒體功能改變的影響進(jìn)行研究探討，為致病菌感染致敗血癥的發(fā)生防治提供新線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)。

資料與方法

1.一般資料

選取2020年1月至2022年5月南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的敗血癥患者60例為觀察組，另選取60例健康體檢者為對照組。所有研究對象及家屬均同意，并簽署同意書，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（2022-0109）。對照組男32例，女28例，年齡（47.23±20.51）歲；觀察組男30例，女30例，年齡（49.21±18.54）歲，病情極危重10例、危重31例、非危重19例；兩組研究對象的性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.入選標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)確診符合敗血癥臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；年齡18～70歲并有平穩(wěn)生命體征的患者；血液細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性且體溫增高的患者；簽署同意書的患者。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重肝腎、心腦血管疾病的患者；合并免疫系統(tǒng)疾病的患者；嚴(yán)重精神疾病、活動期癲癇的患者；合并腫瘤和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病的患者；哺乳期、妊娠期婦女。

3.試驗儀器及試劑

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）儀（型號：CFX96，上海土森視覺有限公司）；PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀（型號：164-5051，美國 Bio-Rad公司）；RT-qPCR試劑盒（貨號：7000，美國 ABI 公司）；Trizol試劑（貨號：Invitrogen，上海文韌有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：XY-TE-0738，上海烜雅有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（貨號：KGP113，江蘇凱基有限公司）；Lipofectamine2000（貨號：YT1317，北京伊塔有限公司）；雪膽乙素（貨號：YG11510，上海韻泰有限公司）；PI染色液（貨號：SY1196，北京伊塔有限公司）；Hoechst 33342染色液（貨號：PR1856，北京普非有限公司）；倒置熒光顯微鏡（型號：BM4000，上海玉研有限公司）；三磷酸腺苷（ATP）檢測試劑盒（貨號：PH0500，北京普非有限公司）。

4.試驗方法

（1）標(biāo)本采集：于觀察組入院后治療前、對照組體檢時，早晨8點(diǎn)空腹抽取兩組研究對象靜脈血 5 ml，加入抗凝劑后，在3 000 r/min（離心半徑為10 cm）的條件下離心10 min，取上清液放入干凈凍存管內(nèi)置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）RT-qPCR法檢測gC1qR表達(dá)：取兩組研究對象血清，嚴(yán)格按照RT-qPCR試劑盒步驟進(jìn)行檢測，用Trizol試劑提取總RNA，用電泳儀檢測其完整性，根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；利用RT-qPCR儀，gC1qR引物序列為 ：上 游 CGGAATTCGGTCCTATCTCTAGGGGGCG，下 游GCTCTAGAAGGTGGGATGCTGTTGTTGA，GAPDH 引 物 序列 ： 上 游 GTAAGAAACCCTGGACCACC， 下 游CTGGGATGGAATTGTGAGGG，在95 ℃條件下預(yù)變性 5 min，95 ℃ 3 s，58 ℃ 15 s，72 ℃反應(yīng) 30 s，此循環(huán)進(jìn)行40次，72 ℃延伸10 min，收集gC1qR熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以同一樣本中的GAPDH的 Ct值作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算其基因相對表達(dá)量。（3）巨噬細(xì)胞的提?。喝∮^察組患者血清置于離心管中，加入4型膠原酶使其終濃度為1 mg/ml，在37 ℃下，300 r/min（離心半徑為10 cm）的搖床上搖晃1 h后過濾離心，棄掉上清液，重懸后再次離心，棄掉上清液，重懸后在4 ℃下沉淀離心3次，取3次上清液，3次上清液混合后，4 ℃下離心5 min，棄掉上清液，再次重懸后將其小心鋪到25%～50%的Percoll上方，每部分體積為4 ml，然后在室溫、2 000 r/min（離心半徑為10 cm）、降速調(diào)為1的條件下進(jìn)行梯度離心20 min，離心后在25%與50%界限處的為巨噬細(xì)胞。（4）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取巨噬細(xì)胞，將其分化為空轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)6個樣本。然后將構(gòu)建好空載體和gC1qR低表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體分別加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液中，混合均勻后溫室條件下孵育10 min，然后分別取等量目的基因加入脂質(zhì)體中配置成轉(zhuǎn)染液，巨噬細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染液按分組依次加入孔板，并加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基使總體積到達(dá)1 ml，轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。（5）巨噬細(xì)胞焦亡檢測：取轉(zhuǎn)染完成后的巨噬細(xì)胞，將其接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后加入脂多糖反應(yīng)4 h，加入4 mmol/L ATP刺激1 h，加入2 mg/L碘化丙啶（PI）和5 mg/L Hoechst 33342溫室染色10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡情況并拍照。（6）巨噬細(xì)胞線粒體功能檢測：取轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞，接種于24孔板中并置于冰上，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，加入80 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，裂解30 min后，在4 ℃、12 000 r/min（離心半徑為10 cm）的條件下離心10 min，取上清液用生物發(fā)光法檢測ATP含量，實(shí)驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

5.統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；Pearson相關(guān)性分析評估gC1qR和巨噬細(xì)胞焦亡及線粒體功能相關(guān)性；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組gC1qR表達(dá)結(jié)果

觀察組、對照組血清gC1qR mRNA表達(dá)分別為（2.31±0.21）、（1.00±0.00），觀察組gC1qR表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=48.320，P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組研究對象的球狀C1q受體（gC1qR）表達(dá)

2.gC1qR對巨噬細(xì)胞焦亡的影響

空轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞焦亡率分別為（41.36±5.21）%、（15.44±2.11）%，轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞焦亡率低于空轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.300，P＜0.001），見圖2。

圖2 空轉(zhuǎn)染組（A）與轉(zhuǎn)染球狀C1q受體（gC1qR）組（B）敗血癥患者巨噬細(xì)胞焦亡率比較

3.gC1qR對巨噬細(xì)胞線粒體功能的影響

空轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞ATP含量分別為（8.24±2.56）μmol/L、（38.47±4.89）μmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.420，P＜0.001），見圖3。

圖3 空轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染球狀C1q受體（gC1qR）組敗血癥患者巨噬細(xì)胞三磷酸腺苷（ATP）含量比較

4.相關(guān)性分析

gC1qR與巨噬細(xì)胞焦亡呈正相關(guān)（r=0.879，P＜0.001）、與ATP呈負(fù)相關(guān)（r=-0.957，P＜0.001），見圖4。

圖4 60例敗血癥患者的球狀C1q受體（gC1qR）mRNA表達(dá)與巨噬細(xì)胞焦亡率（A）、三磷酸腺苷（ATP）含量（B）的相關(guān)性分析

討 論

敗血癥是臨床常見疾病，病情復(fù)雜且進(jìn)展迅速，嚴(yán)重者可引發(fā)休克、彌漫性血管內(nèi)凝血以及多器官功能衰竭，最終危及生命，因此該病已經(jīng)成為重癥監(jiān)護(hù)病房患者最主要的死亡原因之一，這不僅給患者的身心健康造成了嚴(yán)重傷害 ，也給患者及其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［6］。目前，雖然高效抗生素的不斷問世以及日臻完善的器官支持和重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)在一定程度上降低了敗血癥的病死率，但由敗血癥引發(fā)的靶器官功能障礙與衰竭而導(dǎo)致的病死率近年來一直居高不下，因此探尋新型有效的治療靶點(diǎn)以及敗血癥發(fā)病機(jī)制一直是臨床工作的首要任務(wù)［7］。所以，本文就gC1qR在敗血癥中的表達(dá)及對敗血癥患者巨噬細(xì)胞焦亡和線粒體功能改變的影響進(jìn)行研究探討，以期為臨床治療及發(fā)生的機(jī)制提供理論依據(jù)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組gC1qR表達(dá)顯著升高，這說明gC1qR基因有可能參與調(diào)控敗血癥感染。敗血癥主要是由病原菌入侵機(jī)體血液而引起的炎癥感染性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全闡明，因此探尋其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找糖尿病根治方法是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直關(guān)注的焦點(diǎn)之一［1］。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，gC1qR在機(jī)體抗病毒、抗感染等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，其可通過與多種病毒、細(xì)菌、細(xì)胞的蛋白結(jié)合，來參與宿主細(xì)胞防御，進(jìn)而影響機(jī)體抗病毒、抗感染途徑，故可推測gC1qR在敗血癥中可能發(fā)揮重要作用［5］。安斌［8］研究發(fā)現(xiàn)，gC1qR在病毒感染的豬組織病變中呈高表達(dá)，gC1qR基因敲除后，其病理變化有所減輕，提示gC1qR在病毒感染的豬模型中發(fā)揮重要作用，這與本文類似。

本文結(jié)果顯示，與空轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞焦亡率顯著降低，ATP含量顯著升高，這說明抑制gC1qR表達(dá)可顯著抑制巨噬細(xì)胞焦亡，并改善線粒體功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥的發(fā)生、發(fā)展與固有免疫過程密切相關(guān)，而巨噬細(xì)胞作為固有免疫過程中的第一響應(yīng)細(xì)胞，其在機(jī)體抵御病原菌入侵以及多種微生物引發(fā)的敗血癥感染的控制中發(fā)揮重要作用［3］。細(xì)胞焦亡是一種新的促炎性細(xì)胞死亡方式，研究表明，適度的細(xì)胞焦亡可有效殺滅病原體，是機(jī)體防御的重要組成部分，但過度細(xì)胞焦亡，則會引起機(jī)體炎性反應(yīng)失控，導(dǎo)致過度免疫應(yīng)答及炎癥因子釋放，最終引發(fā)多臟器衰竭和死亡，因此調(diào)控細(xì)胞焦亡有望成為一種全新的防治敗血癥手段，而線粒體功能障礙是近年來提出的有關(guān)細(xì)胞焦亡的重要機(jī)制之一，因此越來越受到臨床的關(guān)注及重視［4］。對于敗血癥患者，低表達(dá)gC1qR可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)gC1qR的轉(zhuǎn)錄及翻譯，從而影響細(xì)胞因子表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，抑制半胱天冬酶-1等，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞焦亡并改善線粒體功能的目的，最終有效治療疾病。梁譯丹［9］研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥小鼠中巨噬細(xì)胞焦亡顯著增加，給予治療后巨噬細(xì)胞顯著受抑制，這與本文結(jié)果類似。

為證實(shí)gC1qR基因在敗血癥發(fā)生中的重要作用，我們提取敗血癥全血巨噬細(xì)胞，初步觀察了低表達(dá)對巨噬細(xì)胞細(xì)胞焦亡及線粒體功能的影響，并對其做了相關(guān)性分析，本文結(jié)果顯示，gC1qR與巨噬細(xì)胞焦亡呈正相關(guān)、與ATP呈負(fù)相關(guān)，這說明gC1qR與敗血癥巨噬細(xì)胞焦亡及線粒體功能改變具有相關(guān)性。ATP是反映線粒體功能的有效指標(biāo)，故本文檢測其水平的變化以觀察線粒體功能的變化情況［17］。對于敗血癥患者，低表達(dá)gC1qR可能是通過促進(jìn)其與配體結(jié)合成復(fù)合體，從而抑制gC1qR進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)蓄積，相關(guān)炎性因子及促凋亡因子的分泌，進(jìn)而促進(jìn)ATP的合成，改善線粒體膜電位，到達(dá)有效調(diào)控細(xì)胞焦亡的目的，最終有效改善疾病癥狀。陳廣基和馬雪楓［10］研究表明，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞焦亡顯著增加，給予雪膽乙素可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化與細(xì)胞焦亡，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，gC1qR在敗血癥患者中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，gC1qR可促進(jìn)巨噬細(xì)胞焦亡，并導(dǎo)致線粒體功能紊亂。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突