陳威風(fēng)，李曉雪，裴蘭梅，常惟丹，崔麗偉，潘春梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450046)

志賀氏菌(Shigella)又稱痢疾桿菌，可以侵襲結(jié)腸上皮細(xì)胞，并可能通過穿透和破壞結(jié)腸上皮而導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)細(xì)菌性痢疾[1-2]。志賀氏菌根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同可劃分為痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、福氏志賀菌(Shigellaflexneri)、鮑氏志賀菌(Shigellaboydii)和宋內(nèi)氏志賀菌(Shigellasonnei)，福氏志賀菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸、耐鹽能力，并且可以在水和許多種類的食物中生存和生長。由志賀氏菌引起的食源性疾病暴發(fā)通常是由于攝入了受污染的水和即食食物而導(dǎo)致的[3-4]，其臨床癥狀包括腹痛腹瀉、寒戰(zhàn)高熱以及反復(fù)驚厥等，嚴(yán)重時可危及生命[5]。在過去的幾十年里，志賀氏菌病的發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家和發(fā)達(dá)國家都很流行[6]。

目前最常用于檢測志賀氏菌的方法是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，利用傳統(tǒng)方法往往具有培養(yǎng)時間較長、費時費力、需要5～7 d才能出結(jié)果等缺點，因此迫切需要一種簡單、低成本、高選擇性、靈敏且準(zhǔn)確的福氏志賀菌檢測方法。除此之外，目前也有研究者建立了PCR法[7]﹑滾環(huán)擴(kuò)增法[8]﹑環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)[9]﹑核酸等溫擴(kuò)增方法[10]﹑免疫法和生物傳感器法[11-12]。盡管以上方法都能夠?qū)δ繕?biāo)菌進(jìn)行精準(zhǔn)檢測，然而，有些方法卻仍需要較長時間(超過10 h)來進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和DNA提取。此外，在檢測的過程中還會受到食品基質(zhì)的影響，從而降低檢測效果?；瘜W(xué)發(fā)光(chemiluminescence, CL)以其靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、操作簡單、對環(huán)境無污染而廣泛應(yīng)用于食品安全[13]、藥理學(xué)[14]和病毒[15]等領(lǐng)域。磁分離技術(shù)主要用到的材料是磁性納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)，該粒子是含有磁性金屬或具有獨特超順磁特性的金屬氧化物的納米粒子[16]，可與酶、抗體、DNA等多種功能分子結(jié)合。利用磁性納米粒子的超順磁性可以實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的快速分離、富集和純化，從而有效地縮短富集時間，消除樣品基質(zhì)對檢測靈敏度的影響，大大提高檢測效率。磁分離技術(shù)因其特異性好和效率高等特點而被應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、化工及環(huán)境衛(wèi)生等[17～22]領(lǐng)域。

本研究以福氏志賀菌為靶標(biāo)，將福氏志賀菌適配體和磁性納米材料連接起來構(gòu)建捕獲探針，同時設(shè)計福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列，并將其與發(fā)光試劑魯米諾連接起來構(gòu)建信號探針，當(dāng)福氏志賀菌和信號探針同時存在時，它們會與體系中的捕獲探針進(jìn)行競爭性結(jié)合，在磁場作用下，上清液中的信號探針越少，發(fā)光強(qiáng)度越低。上清液中的穩(wěn)態(tài)化學(xué)發(fā)光信號的發(fā)光強(qiáng)度與福氏志賀菌濃度存在正相關(guān)。因此通過檢測上清液中的化學(xué)發(fā)光信號就可以實現(xiàn)對福氏志賀菌的定量檢測。該方法可以從復(fù)雜的食品基質(zhì)中快速捕獲靶標(biāo)，無需對其進(jìn)行前富集處理，可以快速高效地對牛奶和豬肉中的福氏志賀菌進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AuCl4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖，美國SIGMA公司；乙酸鈷、硅酸四乙酯，上海麥克林生化有限公司；三羥甲基氨基甲烷、親和素，北京索萊寶科技有限公司；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、魯米諾，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；戊二醛，山西益鑫泰生物科技有限公司。

福氏志賀菌適配體序列(FSZ-1)：5′-Biotin-CCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCC-TGTGTGCCTTGAGCGTTTCTGAGCT-3′[23]，福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列(FSZ-2HH)：5′-HS-(CH2)6-AAACGCTCAAGGCACAC-3′。

1.2 儀器與設(shè)備

MP-EII電致化學(xué)發(fā)光檢測儀，西安瑞邁分析儀器有限公司；DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XFH-75CA電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；HR/T16MM微量高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；BluStarB紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；SPC150TEM透射電鏡，深圳市速普儀器有限公司。

1.3 魯米諾功能化花狀納米金的制備

魯米諾功能化花狀納米金(Luminol-AuNFs)是通過魯米諾和殼聚糖共同還原氯金酸制得。具體操作步驟如下：先稱取0.2 g殼聚糖溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的冰乙酸溶液中，然后取1 mL 0.1 mol/L魯米諾儲備液到上述溶液中，加水至95 mL，加熱至沸騰，同時劇烈攪拌，快速加入5 mL質(zhì)量濃度2 g/L的氯金酸儲備液，在沸騰狀態(tài)下保持30 min。最后將制得的產(chǎn)物冷卻至室溫，避光保存于4 ℃條件下，備用。

1.4 氨基化磁性納米Fe3O4的制備

按文獻(xiàn)[24]的方法合成氨基化磁性納米Fe3O4，具體操作步驟如下：首先稱取100 mg的納米Fe3O4，將其溶解于一定溶液[V(無水乙醇)∶V(水)=3∶1]中，加入6 mL氨水，于室溫下超聲5 min；然后加入2 mL正硅酸乙酯，置于搖床中孵育(200 r/min，6 h)；最后結(jié)合磁分離，同時用無水乙醇洗滌2次，即可得到硅烷化磁性納米Fe3O4；配制體積分?jǐn)?shù)95%～97%的乙醇溶液，取160 mL，然后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5～5.5；向上述溶液中添加8 mL硅烷偶聯(lián)劑，振蕩5 min后加入制備的硅烷化磁性納米Fe3O4進(jìn)行反應(yīng)(200 r/min，2 h)；最后結(jié)合磁分離，同時用無水乙醇洗滌2次，將其置于烘箱中(110 ℃，30 min)，取出后放入干燥皿中備用。

1.5 信號探針的構(gòu)建

信號探針是通過Luminol-AuNFs連接FSZ-2HH后得到的復(fù)合物。根據(jù)LI等[25]的方法，首先取5 mL Luminol-AuNFs離心，將沉淀的納米粒子分散于0.5 mL Tris-HCL緩沖液(30 mmol/L，pH 7.4)中得到Luminol-AuNFs膠體溶液。其次，將福氏志賀菌適配體的互補(bǔ)序列(150 μL，2.5 μmol/L)和TCEP(75 μL，2.5 μmol/L)在搖床中孵育30 min，然后加入到Luminol-AuNFs膠體溶液中，并置于搖床中振蕩孵育6 h，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗多次，離心收集所得納米材料，最后將制得的信號探針分散于PBS緩沖液中。

1.6 捕獲探針的構(gòu)建

稱取10 mg氨基化磁性納米Fe3O4，用移液槍取5 mL PBS(pH 7.4)，超聲5 min，加入1.25 μL質(zhì)量濃度250 g/L戊二醛溶液，避光，孵育2 h(37 ℃，130 r/min)。磁分離，加入5 mL PBS，超聲5 min，棄上清液，如此重復(fù)操作2次，加入2.25 mL PBS，超聲5 min，加入750 μL 0.5 mg/mL親和素，超聲，避光孵育12 h(37 ℃，130 r/min)，磁分離(取上清液測紫外)，加5 mL PBS，清洗磁珠2次，加10 mL PBS，超聲5 min，制成親和素標(biāo)記的Fe3O4。棄上清液100 μL，加入100 μL 10 μmol/L適配體，然后孵育6 h(37 ℃，130 r/min)，磁分離(取上清液測紫外)，清洗3次，制得經(jīng)適配體修飾的磁性納米材料，即捕獲探針。

1.7 發(fā)光體系的構(gòu)建

將0.2 mL Luminol-AuNFs與0.5 mL發(fā)光緩沖溶液B混合，然后通過靜脈注射測定化學(xué)發(fā)光。向緩沖溶液A中加入0.1 mol/L的NaOH溶液、30 mmoL/L的Co2+和0.2 mol/L的H2O2溶液制得發(fā)光緩沖溶液B，緩沖溶液A是0.1 mol/L，pH 9.0的碳酸鹽緩沖液。

1.8 福氏志賀菌的檢測

首先，取0.2 mL捕獲探針和0.2 mL信號探針在37 ℃條件下孵育1 h，利用磁分離技術(shù)去除上清液，然后取一系列不同濃度福氏志賀菌0.2 mL于上述沉淀中繼續(xù)在37 ℃條件下孵育1 h。磁分離后取0.2 mL上清液于檢測池中，通過靜脈注射加入0.5 mL發(fā)光緩沖溶液B，記錄發(fā)光信號值。

1.9 選擇性實驗

通過干擾實驗對本研究方法的選擇性進(jìn)行測定，干擾細(xì)菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌。依照上述對福氏志賀菌的檢測方法對選取的其他致病菌進(jìn)行等濃度檢測，濃度均為500 CFU/mL，同時記錄體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化(ΔCL=CL-CL0，其中，CL表示體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，CL表示當(dāng)體系中存在福氏志賀菌以及其他致病菌時的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，CL0表示當(dāng)體系中不存在任何致病菌時的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度)。

1.10 實際樣品檢測

為了驗證該方法在食品中應(yīng)用的可行性，本實驗選取牛奶和生鮮豬肉進(jìn)行加標(biāo)實驗。牛奶和生鮮豬肉樣本購自當(dāng)?shù)爻?，配制一定濃度的福氏志賀菌菌液(5.7×102CFU/mL)，分別吸取1～25 mL無菌奶樣品和25 g豬肉樣品，混合均勻后，利用以上建立的方法進(jìn)行檢測，同時利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對以上結(jié)果進(jìn)行驗證，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯米諾功能化花狀納米金的表征

利用透射電鏡表征合成的魯米諾納米金復(fù)合材料，從圖1-a可以看出，合成材料均勻分布，粒徑大小均一，從圖1-b可以看出單一納米材料呈現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為50 nm?；罱Y(jié)構(gòu)可以有效地增大納米材料表面積，其形成機(jī)制如下：魯米諾和殼聚糖作為氯金酸的共還原劑，與單一還原劑相比，具有更強(qiáng)的還原性，在制備初期，氯金酸被還原成大量的納米點，進(jìn)而形成花狀的金納米顆粒。殼聚糖的用量決定了Luminol-AuNFs顆粒的粒徑，殼聚糖用量越少，合成的物質(zhì)粒徑越大，反之同理。

a-×5 000；b-×100 000圖1 魯米諾功能化花狀納米金在不同放大倍數(shù)下的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy of Luminol functionalized flower-like gold nanoparticles at different magnification

2.2 磁性納米Fe3O4及氨基化磁性納米Fe3O4的表征

圖2是磁性納米粒子的X-射線衍射(X-ray diffraction, XRD)表征圖。在20°～70°呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的晶體衍射峰，結(jié)果表明，產(chǎn)物具有良好的結(jié)晶度，即產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為尖晶石結(jié)構(gòu)。圖2-a特征峰與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS 65-3107)表示的衍射峰完全一致，6個特征峰分別為2θ=30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°、62.6°，晶面指數(shù)分別為220、311、400、422、511、440。從圖中可以看出，b特征峰與a特征峰大致相同，只有衍射峰的寬度不太相同，這可能與粒徑不同相關(guān)。因此，納米粒子在小范圍內(nèi)具有細(xì)觀有序結(jié)構(gòu)，在氨基化之后也不能改變Fe3O4的晶型。

a-納米Fe3O4；b-氨基化納米Fe3O4圖2 磁性納米Fe3O4的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction of magnetic nanometer ferric oxide

2.3 捕獲探針和信號探針的表征

圖3-a為親和素修飾前后的氨基化磁性納米Fe3O4的紫外光譜圖。圖3-a表示未經(jīng)修飾的氨基化磁性納米Fe3O4的吸光度，而圖3-b表示修飾后的氨基化磁性納米Fe3O4，在280 nm處吸光度值有明顯下降，表明親和素與氨基化磁性納米Fe3O4成功連接。如圖3-b所示，經(jīng)對適配體原液與親和素化的氨基化磁性納米Fe3O4孵育前后的上清液進(jìn)行吸光度值測定后，發(fā)現(xiàn)在260 nm處孵育后的吸光度(b)較孵育前的吸光度(a)明顯下降，說明適配體序列已連接在親和素修飾后的氨基化磁性納米Fe3O4的表面，即成功制備了捕獲探針。

圖3 親和素原液(a)和氨基化磁性納米Fe3O4與親和素反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖(A)；福氏志賀菌適配體原液(a)和親和素化磁性納米Fe3O4與福氏志賀菌適配體反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖(B)Fig.3 UV spectrogram of the supernatant (b) after the reaction of avidin stock solution (a) and amininated magnetic nano-Fe3O4 with avidin (A);Ultraviolet spectrogram of S. flexneri aptamer raw solution (a) and avidinized magnetic nano-Fe3O4supernatant (b) after reaction with S. flexneri aptamer (B)

信號探針是由巰基化的福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金連接而成的。巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列可以通過Au—S鍵與納米金進(jìn)行連接，為了提高連接效率而加入TCEP，TCEP的功能是損壞位于巰基化核酸適配體互補(bǔ)序列內(nèi)部和2條核苷酸序列之間的S—S共價鍵，以便巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列與納米金形成Au—S鍵。

圖4是巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列修飾前后的魯米諾功能化花狀納米金的紫外光譜圖，與未經(jīng)修飾的魯米諾功能化花狀納米金對比，經(jīng)適配體互補(bǔ)序列修飾的魯米諾功能化花狀納米金的上清液在260 nm處的吸光度值明顯下降，表明適配體的互補(bǔ)序列已經(jīng)連接在魯米諾功能化花狀納米金的表面，進(jìn)而證明信號探針制備成功。

圖4 福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列原液(a)和魯米諾功能化花狀納米金與互補(bǔ)序列反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrogram of the original solution (a) of the S. flexneri aptamer complementary sequence and the supernatant solution (b) of the Luminol functionalized flower-like gold nanoparticles after the reaction with the complementary sequence

2.4 實驗條件的優(yōu)化

通過單變量實驗對影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的適配體的互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金的孵育時間、H2O2濃度、緩沖溶液的pH、Co2+的濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如圖5所示。

a-孵育時間；b-緩沖液中H2O2濃度；c-緩沖液pH；d-Co2+濃度圖5 福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金的孵育時間、緩沖液中H2O2濃度、緩沖液pH以及Co2+濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of inincubation time of S. flexneri aptamer complementary sequence and luminol functionalized flower-like gold nanoparticles, H2O2 concentration, buffer pH and CO2 + concentration on chemiluminescence intensity

福氏志賀菌適配體的互補(bǔ)序列和福氏志賀菌會競爭性結(jié)合福氏志賀菌的核酸適配體，所以信號探針上的適配體互補(bǔ)序列與Luminol-AuNFs粒子之間的孵育時間在檢測過程中是非常重要的。如圖5-a所示，在待測時間范圍內(nèi)，紫外吸光度值的差值隨著時間的增加而減小，待出現(xiàn)最大值后再次減小。因此，本實驗中互補(bǔ)序列和Luminol-AuNFs的最佳孵育時間為6 h。除此之外，對H2O2濃度、緩沖液的pH和Co2+濃度進(jìn)行了一系列優(yōu)化，由圖5-b～圖5-d可知當(dāng)H2O2的濃度為0.2 mol/L、發(fā)光緩沖液的pH為9.0時，Co2+濃度為30 mmol/L時，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別達(dá)到最大值。因此選擇優(yōu)化后的孵育時間、Co2+濃度、過氧化氫濃度和pH作為該實驗方法的最佳反應(yīng)條件。

2.5 檢測性能分析

當(dāng)體系中不存在福氏志賀菌時，捕獲探針只能和信號探針結(jié)合，此時體系的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度達(dá)到最小值；當(dāng)體系中存在福氏志賀菌時，福氏志賀菌和信號探針會競爭性結(jié)合捕獲探針，此時化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度升高。選取最佳的實驗條件，配制一系列不同濃度的福氏志賀菌菌液，在本實驗構(gòu)建的體系下測定化學(xué)發(fā)光，從而得到不同濃度福氏志賀菌的化學(xué)發(fā)光光譜圖和線性曲線圖(圖6)。

圖6 福氏志賀菌濃度和電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.6 Correlation between the concentration of S. flexneri and chemiluminescence intensity

該實驗所構(gòu)建的體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與福氏志賀菌的濃度呈正相關(guān)，同時在福氏志賀菌濃度為2.6×10～2.6×105CFU/mL具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為Y=68.480 02+272.065 6X，R2=0.995 02，檢測限為12 CFU/mL。LUO等[26]開發(fā)了一種用于檢測糞便和血液中志賀菌的免疫傳感器，檢出限可以達(dá)到21和18 CFU/mL。FENG等[27]開發(fā)一種適用于福氏志賀菌的納米金比色法，檢出限達(dá)到80 CFU/mL。與以上2種方法相比，本研究建立的方法具有更低的檢出限值。

2.6 選擇性實驗結(jié)果

如圖7所示，當(dāng)福氏志賀菌存在時，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化較大，說明捕獲探針上連接的適配體可以與福氏志賀菌發(fā)生特異性結(jié)合，從而使得本實驗所構(gòu)建的適配體傳感器對福氏志賀菌呈現(xiàn)良好的特異性；而當(dāng)其他致病菌存在時，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化不明顯，即表明捕獲探針上連接的適配體不能與它們發(fā)生特異性結(jié)合。該結(jié)果說明本文構(gòu)建的檢測方法受到其他致病菌的干擾較小，對福氏志賀菌呈現(xiàn)較高的特異性。

圖7 不同類型細(xì)菌對發(fā)光強(qiáng)度值的影響Fig.7 Effect of different types of bacteria on luminescence intensity

2.7 實際樣品檢測

為了驗證該方法的可行性，利用該方法對市售牛奶和豬肉進(jìn)行加標(biāo)檢測。如表1所示，福氏志賀菌的加標(biāo)回收率在95.4%～114.4%，相對偏差(n=3)在1.4%～3.9%，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 本方法對牛奶和豬肉中福氏志賀菌加標(biāo)回收檢測結(jié)果(n=3)Table 1 Recovery of S. flexneri in milk and pork (n=3) using this method

3 結(jié)論

本研究以納米Fe3O4為原料制得氨基化磁性納米Fe3O4，以魯米諾和殼聚糖作為共還原劑對氯金酸進(jìn)行還原合成魯米諾功能化花狀納米金。在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建用于檢測福氏志賀菌的核酸適配體傳感器，呈現(xiàn)良好的特異性。利用本實驗構(gòu)建的檢測方法對市售牛奶和豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，其加標(biāo)回收率在95.4%～114.4%，相對偏差(n=3)在1.4%～3.9%，本方法的建立為今后食源性致病菌的快速檢測提供了新的思路。