丁沈利，毛炳杰，陸信曜，諸葛斌，宗紅

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

豌豆蛋白是一種新興的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1-3]，因其高蛋白含量、高消化率、低致敏性且富含促進(jìn)人體肌肉增長的賴氨酸而越來越受歡迎[4]。豌豆分離蛋白(pea protein isolate, PPI)可添加到飲料、肉制品以及面點等食品中，不僅可以提高產(chǎn)品性能[5]，還可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，補(bǔ)充人體谷物蛋白質(zhì)，均衡營養(yǎng)[6]。豌豆蛋白可作為傳統(tǒng)動物蛋白及大豆蛋白的替代品應(yīng)用于食品開發(fā)，提高食品的營養(yǎng)價值和功能特性，因此有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在我國，目前豌豆蛋白主要是作為豌豆加工的副產(chǎn)物應(yīng)用于飼料加工中，造成了利用率低和蛋白資源浪費(fèi)的問題[7]。豌豆蛋白具有強(qiáng)烈的且不易消除和掩蓋的不良風(fēng)味，風(fēng)味是豌豆蛋白產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。豌豆低聚肽在制備過程中往往會產(chǎn)生苦味，嚴(yán)重影響其口感品質(zhì)。水解過程中，在肽鏈末端產(chǎn)生的疏水性氨基酸通常會使肽呈現(xiàn)苦味，且多數(shù)苦味肽是由2～10個氨基酸組成的小分子肽[8]。

酶水解是目前降低肽類苦味的有效方法[9-12]。羧肽酶(carboxypeptidases)是一類外切蛋白酶，能夠從蛋白質(zhì)或多肽鏈的C端特異性切割產(chǎn)生游離羧基酸，在蛋白水解產(chǎn)品的脫苦及風(fēng)味改善中起重要作用[13]。然而目前尚未有成熟的商品羧肽酶應(yīng)用于食品中，關(guān)于羧肽酶的研究仍主要集中在異源表達(dá)、分離純化及性質(zhì)表征等方面[14-15]。因此，開發(fā)可應(yīng)用于食品的新型羧肽酶能有效填補(bǔ)市場空白。本研究利用前期已獲得的一種新型羧肽酶M32制備低苦味豌豆低聚肽，該酶具有較好的耐熱性(最適溫度為60 ℃)，與已報道的羧肽酶A、羧肽酶B和羧肽酶Y相比，對C末端氨基酸具有更高的廣譜性，偏好水解疏水性較強(qiáng)的氨基酸殘基，且該酶的最適pH為8.0，可直接在堿性環(huán)境中與內(nèi)切酶(堿性蛋白酶)復(fù)配使用。本研究采用堿性蛋白酶和新型羧肽酶M32制備低苦味豌豆低聚肽，并評價其溶解性、水解度、分子質(zhì)量分布、風(fēng)味變化及抗氧化活性等，以探究該酶在低聚肽制備中的潛在能力，為植物蛋白的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

PPI，上海源葉生物科技有限公司；FeSO4、三氯乙酸、Na2HPO4、堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基、底物Z-Glu-Tyr，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-60恒溫水浴鍋，蘇州威爾實驗儀器；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用公司；SA402B味覺分析系統(tǒng)，日本INSENT公司；H1850R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羧肽酶M32的獲得

利用本實驗室構(gòu)建的1株羧肽酶M32重組枯草芽孢桿菌WB600表達(dá)菌株。發(fā)酵液通過鹽析，Ni柱純化后得到羧肽酶M32(5 000 U/mL)。

1.3.2 豌豆低聚肽的制備

配制50 mg/mL的PPI溶液，沸水浴10 min，迅速放入冷水中冷卻至室溫，在溫度50 ℃，pH 7.0的條件下，加入酶底比4%的堿性蛋白酶，水解1.5 h，得到豌豆多肽(pea protein isolate hydrolysed by alkaline protease, PPIA)，然后100 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，加入酶底比4%的羧肽酶M32繼續(xù)酶解，依次在不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)，不同pH(5、6、7、8、9)，不同酶解時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)，不同底物質(zhì)量濃度下(20、40、60、80、100 g/L)進(jìn)行單因素優(yōu)化，獲得豌豆分離蛋白雙酶酶解液(pea protein isolate hydrolysed by alkaline protease and carboxypeptidase M32, PPIACP)，沸水浴10 min滅酶。8 000 r/min，離心15 min，取上清液，凍干后-20 ℃冷凍備用。

1.3.3 水解度測定

采用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)法測定酶解液的水解度，按照公式(1)計算：

(1)

式中：n(SerNH2)，每克PPI的氨基當(dāng)量，mmol；α，常數(shù)0.97；β，常數(shù)0.34；htot，常數(shù)7.80。

1.3.4 溶解性測定

配制1%的樣品溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0，混合振蕩1 min，10 000 r/min，離心15 min取上清液。溶解性按照公式(2)計算：

(2)

1.3.5 DPPH自由基清除活性的測定

采用比色法，用無水乙醇將DPPH配成0.01 mg/mL溶液，與樣品均勻混合，避光處理30 min，在517 nm下測定樣品的吸光度，DPPH自由基清除率按照公式(3)計算：

(3)

式中：Ai，100 μL蛋白水解液+100 μL 0.01 mg/mL DPPH無水乙醇溶液的吸光度；Aj，100 μL蛋白水解液+100 μL空白試劑(無水乙醇)的吸光度；A0，100 μL 0.01 mg/mL DPPH無水乙醇溶液+空白試劑(無水乙醇)的吸光度。

1.3.6 ·OH清除活性的測定

采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。加入不同含量PPI酶解液50 μL，50 μL 9 mmol/L FeSO4，50 μL 10 mmol/L水楊酸，50 μL 8.8 mmol/L H2O2混勻，37 ℃反應(yīng)30 min后，于510 nm處測定樣品吸光度Ai，將體系中的樣品改為加入50 μL蒸餾水，測定空白對照吸光度A0，向體系中加入50 μL蒸餾水代替8.8 mmol/L H2O2時，測定樣品本底吸光度Aj，其中每個質(zhì)量的樣品濃度做3個平行，以維生素C作陽性對照。·OH清除率按照公式(4)計算：

(4)

1.3.7 氨基酸的測定

采用氨基酸高效液相色譜儀測定。

1.3.8 電子舌

使用味覺傳感系統(tǒng)對PPI酶解液風(fēng)味進(jìn)行評估。以標(biāo)準(zhǔn)液為對照液，采用電子舌味覺傳感器CTO(咸味)、AAE(鮮味)和COO(苦味)分別對PPI酶解產(chǎn)物的咸、鮮、苦、苦余味和豐富度進(jìn)行分析。

1.3.9 統(tǒng)計分析

以上測定均為3組平行試驗，結(jié)果取3組試驗數(shù)據(jù)的平均值。利用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算，P<0.05表示具有顯著性差異。試驗數(shù)據(jù)圖均利用Origin 2021軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧肽酶M32酶解PPIA最適條件優(yōu)化

PPI經(jīng)堿性蛋白酶初步水解后，以水解度為初步考察指標(biāo)，分別對影響羧肽酶M32酶解效果的溫度、pH、酶解時間和底物濃度進(jìn)行優(yōu)化。由圖1可知，羧肽酶M32酶解PPIA的最適條件為60 ℃，pH 7，酶解時間2 h，底物質(zhì)量濃度60 g/L，此時水解度可達(dá)15.4%。羧肽酶M32屬于耐熱蛋白酶，其最適酶解溫度是60 ℃，較高的酶解溫度有利于提高酶活力，而水解度的提高有利于打開PPI的結(jié)構(gòu)，使更多的基團(tuán)暴露，有利于后續(xù)的羧肽酶M32發(fā)現(xiàn)更多的酶解位點。

a-溫度；b-pH；c-酶解時間；d-底物質(zhì)量濃度圖1 PPIA最適酶解條件優(yōu)化Fig.1 Optimum hydrolysis conditions for PPIA

2.2 豌豆低聚肽的溶解性和水解度

豌豆低聚肽的高溶解性是其工藝上使用的關(guān)鍵特征之一，可以對其后期工藝處理產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[16]。水解程度也能夠從側(cè)面體現(xiàn)出小分子多肽的濃度以及功能活性上的改變。如圖2所示，雙酶酶解能顯著提高PPI的溶解性和水解度。

圖2 PPI、PPIA、PPIACP的溶解性和水解度Fig.2 Solubility and hydrolysis degree of PPI, PPIA, PPIACP注：*表示PPIACP在溶解性上與PPIA的顯著性差異(P<0.05)，#表示PPIACP在水解度上與PPIA的顯著性差異(P<0.05)

PPI的溶解性為32.2%；PPIA溶解性58.6%，水解度11.6%；堿性蛋白酶和羧肽酶M32雙酶解制備得到的PPIACP溶解性80.5%，水解度15.4%，與PPIA相比，分別提高了37.4%和33.4%。隨著酶解的進(jìn)行，PPI的溶解性和水解度顯著提高，與堿性蛋白酶相比，羧肽酶M32可進(jìn)一步水解PPIA，讓肽鏈從外部展開，降低分子質(zhì)量，增加了極性基團(tuán)的數(shù)目，小分子多肽在水解度提高的同時，也更易得到分子質(zhì)量更小的肽和氨基酸。范海茹等[17]以高溫豆粕為原料，利用內(nèi)切酶中性蛋白酶和外切酶連續(xù)酶解的方式制備鮮味肽，獲得了水解度顯著提高的酶解產(chǎn)物與本研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明羧肽酶M32在提高水解度方面具有較大優(yōu)勢。

2.3 豌豆低聚肽的分子量分布

酶解會將蛋白質(zhì)水解成短肽和氨基酸，從而改變分子質(zhì)量分布，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的變化也會影響功能及其感官特性[18]。對PPI水解液中分子質(zhì)量占比進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。PPI中90%以上是分子質(zhì)量>5 kDa的大分子質(zhì)量多肽，小分子質(zhì)量多肽組分很低。堿性蛋白酶屬于內(nèi)切蛋白酶，可從蛋白質(zhì)內(nèi)部切割肽鍵，經(jīng)堿性蛋白酶水解后，PPIA水解液中0.2～1 kDa的短肽顯著增加(P<0.05),分子質(zhì)量>5 kDa的多肽含量大大降低。羧肽酶M32屬于外切蛋白酶，可特異地從蛋白質(zhì)的C端切割氨基酸，經(jīng)羧肽酶M32水解后的PPIACP，分子質(zhì)量>1 kDa的多肽進(jìn)一步水解成更短的短肽，分子質(zhì)量在0.2～1 kDa的短肽，與PPIA相比顯著增加(P<0.05)，增加了36.2%。分子質(zhì)量<200 Da的部分主要是游離氨基酸，PPIA占比是7.6%，PPIACP占比是13.8%，提高了6.2%?？梢姡入拿窶32可有效提高PPI水解液中的短肽和氨基酸含量，使更多的大分子多肽水解成小分子的寡肽和氨基酸，小分子物質(zhì)人體更容易吸收，這有利于豌豆多肽發(fā)揮功能。

圖3 PPI、PPIA、PPIACP的分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular weight distribution of PPI, PPIA, PPIACP注：#表示PPIA在0.2～1 kDa區(qū)間上的分子量分布與<0.2 kDa區(qū)間上的顯著性差異(P<0.05)，*表示PPIACP在0.2～1 kDa區(qū)間上的分子量分布與<0.2 kDa區(qū)間上的顯著性差異(P<0.05)

2.4 豌豆低聚肽中游離氨基酸組成

為進(jìn)一步探究影響酶解產(chǎn)物呈味的因素，對豌豆低聚肽中的游離氨基酸組成進(jìn)行了測定，以比較雙酶解前后鮮味氨基酸(Glu、Asp、Ala、Phe、Gly、Tyr)和苦味氨基酸(Ser、His、Arg、Val、Met、Ile、Leu)含量的變化。如圖4所示，經(jīng)堿性蛋白酶水解后，多肽鏈末端的氨基酸被大量暴露出來，加入羧肽酶M32后，位于C端的氨基酸被釋放出來，呈游離狀態(tài)，其中苦味氨基酸His、Arg、Val、Leu含量顯著增加了17.4%(P<0.05)，鮮味氨基酸提高了3.8%。C端苦味氨基酸的脫除有利于減少苦味肽的平均疏水性，降低苦味肽的苦味。

圖4 PPI、PPIA、PPIACP中游離氨基酸含量熱圖Fig.4 Heat map of free amino acid content in PPI, PPIA and PPIACP

PPI經(jīng)堿性蛋白酶水解后，大分子蛋白逐漸被水解，相對分子質(zhì)量降低，酶解液中的肽含量升高，也造成了肽鏈末端的疏水性基團(tuán)暴露，酶解液中苦味肽的含量亦增加，再加入羧肽酶M32后，可將苦味肽C端的疏水性氨基酸釋放出來，使其呈游離狀態(tài)，苦味降低。研究發(fā)現(xiàn)，水解物的呈味特性與氨基酸的組成有關(guān)，黃百祺等[19]比較了4種龜肉酶解液氨基酸與呈味的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)以疏水性氨基酸為主的龜肉酶解液與其他組相比會有較大的味道強(qiáng)度差。本研究根據(jù)酶解產(chǎn)物呈現(xiàn)苦味的問題，利用羧肽酶M32將堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行二次酶解，從而降低苦味，改善風(fēng)味。

2.5 豌豆低聚肽風(fēng)味分析

為研究不同酶解產(chǎn)物的呈味特性，利用電子舌技術(shù)分別對PPI、PPIA、PPIACP進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果進(jìn)行分析[20-21]。由圖5可知，與PPIA相比，PPIACP的苦味、鮮味、甜味較為顯著(P<0.05)，在苦的回味、咸味、豐富度方面也表現(xiàn)出差異，但不顯著。其中，苦味值由5.09變?yōu)?.93，降低了22.8%；鮮味由18.9變?yōu)?1.7，提高了20.9%?？偟膩碚f，PPIACP風(fēng)味變化明顯，這表明羧肽酶M32具有抑苦增鮮的作用，這是因為它可以在肽鏈末端切斷氨基酸，并釋放出C端的氨基酸，特別是疏水性氨基酸、短肽及氨基酸含量和組成的變化使得PPIACP的風(fēng)味發(fā)生改變。而堿性蛋白酶的主要降解位點則是芳香族氨基酸殘基的羧基端肽鍵，在酶解后會使肽鏈C端的疏水性氨基酸增多，增加了不良風(fēng)味的強(qiáng)度。以上結(jié)果表明，堿性蛋白酶+羧肽酶M32復(fù)合酶解的水解產(chǎn)物比單酶解的水解產(chǎn)物呈味特性更豐富，羧肽酶M32在植物蛋白水解物脫苦中具有很大的應(yīng)用潛力。

圖5 電子舌風(fēng)味圖Fig.5 Electronic tongue flavour radar chart

2.6 豌豆低聚肽抗氧化能力分析

分別從DPPH自由基清除率，·OH清除率2個方面評價豌豆低聚肽PPIA和PPIACP的抗氧化能力。如圖6-a所示，PPIACP的DPPH自由基清除率98%，與PPIA相比提高了32.4%。PPIACP的·OH清除率90%，與PPIA相比提高了25.1%(圖6-b)。結(jié)果表明，結(jié)合羧肽酶M32雙酶法制備的豌豆低聚肽的抗氧化活性明顯優(yōu)于單酶法制備的豌豆低聚肽?？寡趸钚栽谀撤N程度上依賴于小分子物質(zhì)的數(shù)量，小分子肽的數(shù)量越多，抗氧化活性越強(qiáng)。根據(jù)圖3的結(jié)果，PPIACP中，分子質(zhì)量<1 kDa的組分占82.6%，與PPIA相比提高了25.3%，含有更多10肽以下的小肽，而目前所研究的抗氧化寡肽大多是少于10個氨基酸殘基的小肽，小肽更容易形成良好的抗氧化物質(zhì)[22-23]，而羧肽酶M32可以使PPIA進(jìn)一步水解產(chǎn)生更多的小分子肽來作為供體，提供更多的電子，與自由基反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為不容易氧化的產(chǎn)物，進(jìn)而停止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過羧肽酶水解釋放的一系列疏水性氨基酸也會提高多肽的抗氧化能力[24]。

a-DPPH自由基清除率；b-·OH清除率圖6 PPI、PPIA和PPIACP的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activities of PPI, PPIA, and PPIACP

3 結(jié)論

本研究利用一種新型羧肽酶M32制備低苦味豌豆低聚肽并對其功能進(jìn)行了評價。通過單因素實驗確定了羧肽酶M32酶解PPIA的最優(yōu)條件為酶解溫度60 ℃，pH 7，酶解時間2 h，底物質(zhì)量濃度60 g/L。羧肽酶M32結(jié)合堿性蛋白酶制備的豌豆低聚肽PPIACP的溶解性和水解度分別為80.6%和15.4%，與堿性蛋白酶單酶制備的豌豆低聚肽PPIA相比，分別提高了37.4%和33.4%。小分子短肽(0.2～1 kDa)增加了36.2%?？辔讹@著降低(P<0.05)，鮮味值提高了20.9%，有利于制備高鮮味低苦味的豌豆低聚肽；PPIACP的DPPH自由基清除率和·OH清除率分別可達(dá)98%和90%，具有很好的抗氧化活性。綜上所述，羧肽酶M32結(jié)合堿性蛋白酶雙酶解制備的豌豆低聚肽PPIACP苦味降低，鮮味增加，且抗氧化效果較好，羧肽酶M32在植物蛋白生物活性肽制備中具有良好的應(yīng)用前景。