汪洪，張林祥，黃炳文，馮緯，陳笑釵，蔣予箭*

1(浙江五味和食品有限公司，浙江 杭州，313213)2(浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州，310018)

浙江玫瑰醋是我國傳統(tǒng)食醋工藝保留較為完整的一種發(fā)酵產品，以其獨具特色的玫瑰色澤以及酸味柔和鮮甜，醋香純正的呈味特點深受江南人民的喜愛。浙江玫瑰醋發(fā)酵工藝包括浸米蒸飯、發(fā)花、沖缸放水、靜態(tài)表面發(fā)酵，在發(fā)酵過程中只利用空氣及草缸蓋上的菌種掉落在米飯上自然繁殖進行發(fā)酵[1]。浙江玫瑰醋在生產過程中多應用人工操作，產品質量多憑員工的實際經驗控制，存在勞動強度大、生產品質難以控制等問題，因此迫切需要應用新型發(fā)酵技術，改進其生產工藝，實現(xiàn)浙江玫瑰醋生產現(xiàn)代化。

補料發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵，是工業(yè)化生產中重要的生化培養(yǎng)模式，通過周期性地放出部分含有產物的發(fā)酵液，同時再補加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，可以減少有害代謝產物的累積，在保證質量的同時還提高了產量[2]。目前在食醋釀造領域補料分割技術相關研究及應用報道較少，主要應用于深層液態(tài)發(fā)酵醋。QI等[3]在細菌發(fā)酵動力學基礎上，優(yōu)化了半連續(xù)食醋發(fā)酵的工藝，得出最佳的出/入料比為工作容積的34%，在此條件下，醋的滴度達到(93.09±0.24)g/L，平均乙?；侍岣叩?1.83±0.01)g/(L·h)，醋的化學計量產率提高到(93.97±0.16)%，為進行大規(guī)模、高強度的食醋發(fā)酵提供了寶貴的參考。在之前的研究中，本課題組也將補料發(fā)酵技術應用于玫瑰醋醋酸發(fā)酵過程中，利用響應面法優(yōu)化得到玫瑰醋最佳補料發(fā)酵工藝參數為：補料時刻為底液初始酸度達到2.85 g/dL時，補料體積為33%，控制發(fā)酵溫度為32 ℃，補料分割1次。利用該工藝參數生產得到的玫瑰醋，酸度比傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋高10%以上，且在有機酸組成及感官評價上與傳統(tǒng)玫瑰醋沒有顯著差異[2]。

本研究在1次分割補料生產玫瑰醋的基礎上，嘗試用多次補料分割發(fā)酵方式生產玫瑰醋，跟蹤對比傳統(tǒng)發(fā)酵、1次分割1次補料以及3次分割3次補料發(fā)酵過程中發(fā)酵曲線、產品色澤、風味以及得率變化，從而為浙江玫瑰醋半連續(xù)生產發(fā)酵的可行性提供可靠借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米：碳水化合物含量75%左右，蛋白質含量7%～8%，脂肪含量1.3%～1.8%，產地安徽。黃酒醪，由機械化大罐生產的黃酒發(fā)酵醪，酒精度7.2% (體積分數)，還原糖含量1%，酸度0.5～0.6 g/dL，發(fā)酵時間長達15 d。葡萄糖、酚酞、無水乙醇、CuSO4、NH4H2PO4、H3PO4等均為分析純,上海麥克林試劑有限公司；草酸、L-酒石酸、丙酮酸、蘋果酸，乳酸、乙酸、焦谷氨酸、琥珀酸、甲醇、2-乙基丁酸等，均為色譜純，Aladdin試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

酒精計，武強縣華洋儀表廠；PHS-3C酸度計，上海雷磁儀器廠；85 μm PA型SPME fiber assembly，美國Supelco公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀，日本島津儀器公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城工貿有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

玫瑰醋多次分割補料發(fā)酵過程見圖1。

圖1 玫瑰醋多次分割-補料發(fā)酵過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the fermentation process of rosy vinegar with multiple divisions and feeding

按照傳統(tǒng)玫瑰醋釀造工藝進行發(fā)花，秈米沖洗后倒入缸中并加水，常溫浸泡7 d，常壓蒸飯(控制出飯率在220%)。米飯冷卻后轉入缸中，中間搭窩，進行發(fā)花。

發(fā)花結束后按米和水質量比約1∶3沖缸放水，進行表面靜態(tài)發(fā)酵，定期攪拌。當發(fā)酵液酸度達到2.5 g/dL時，開始進行分割補料，分割體積設置為缸的1/3，用酒精度為7%的黃酒醪補滿，與發(fā)酵缸中的剩余玫瑰醋發(fā)酵液混勻，繼續(xù)發(fā)酵至酸度2.5 g/dL，重復3次，每次分割出來的發(fā)酵液分別裝入另外設置的分割缸中，控制發(fā)酵溫度為29～33 ℃，發(fā)酵周期120 d左右。

當酸度不再上升時，添加質量分數3%左右食鹽后熟，常溫后熟1個月。

1.3.2 理化指標試驗方法

還原糖含量參照國家標準GB/T 50097—2003斐林試劑滴定法測定；酒精度參照國家標準GB/T 13662—2008蒸餾法測定；總酸含量參照國家標準GB/T 1256—2008酸堿滴定法測定。

1.3.3 玫瑰醋樣品得率測定

將發(fā)酵結束的玫瑰醋按4 g/dL進行稀釋換算，計算各組玫瑰醋得率(得率為4 g/dL的玫瑰醋質量：消耗大米質量)。

1.3.4 玫瑰醋中有機酸的測定

有機酸標準曲線的繪制：根據樣品中的有機酸含量稀釋標準液，配成草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、焦谷氨酸、琥珀酸不同濃度的混合標樣。以不同混標濃度為橫坐標，檢測到的峰面積為縱坐標，通過線性回歸，從而得到各有機酸對應的回歸方程與相關系數，其中草酸：f(x1)=4 732.3x1+743.92(R2=0.999 5)；酒石酸：f(x2)=925.15x2+426.43(R2=0.998 7)；丙酮酸:f(x3)=3 979.7x3+1 132.3(R2=0.999 8)；蘋果酸:f(x4)=466.32x4+226.63 (R2=0.998 3)；乳酸f(x5)=237.75x5+994.24(R2=0.999 6)；乙酸:f(x6)=306.47x6+1 489.2 (R2=0.997 6)；焦谷氨酸:f(x7)=4 143.6x7+1 188.8(R2=0.998 3)；琥珀酸:f(x8)=282.41x8+390 (R2=0.998 7)。

HPLC條件：色譜柱：Spursil C18-EP (4.6 mm×250 mm, 25 μm)；流動相為5%甲醇-95% 6 g/L NH4H2PO4(用磷酸調至pH 2.60)；流速0.8 mL/min；進樣體積5 μL；UV檢測器；檢測波長210 nm。以混合標樣中各有機酸的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，采用峰面積外標法進行定量[4]。

1.3.5 玫瑰醋中揮發(fā)性成分的測定

樣品預處理：取樣品12.5 mL置于20 mL頂空瓶中，用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。先將頂空瓶放入50 ℃恒溫水浴鍋平衡30 min，然后將萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，50 ℃吸附30 min。之后抽回纖維頭，從頂空瓶中拔出萃取頭，取出后將萃取頭量程調為4 cm，插入GC-MS儀的氣相色譜進樣口，推出纖維頭，240 ℃解析2 min，進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.5 μm)；進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，載氣He，恒流模式，柱流速1 mL/min；柱溫30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量數掃描范圍33～500 amu。數據分析：質譜譜庫檢索使用NIST14數據庫。

GC-MS檢測結果通過計算機NIST14譜庫和人工檢索處理，選出匹配度≥80%的化合物并對其定性[5]；同時用內標法對各組分進行半定量分析[6]，以2-乙基丁酸為內標物，根據被測成分與內標物的峰面積之比，計算被測物質的相對于內標的質量濃度。

1.3.6 色澤比較

對發(fā)酵結束的各組玫瑰醋進行色澤測定。將樣品稀釋至原來的50%，5 000 r/min離心20 min，離心后的樣品選擇610 nm波長進行吸光值A610的測定，每個樣品做3組平行，結果取平均值。色率按公式(1)計算[7]：

色率=20×A610/0.076

(1)

1.3.7 感官評定

選取10名具有玫瑰醋感官評價經驗的評分人員，評分前經專業(yè)訓練。以食醋的色澤、透明度、酯香、醋香、焦香、酸味、甜味、鮮味、澀味這9個指標對樣品打分，每個指標的分值按感官刺激作用的強弱給出0～5分，每個樣品重復評價3次，最后取平均值，作出感官定量分析雷達圖。

1.3.8 數據處理

每組實驗平行測定3次，結果以平均值±標準差表示。采用Excel和Origin 9.0對數據進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 22.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 多次補料分割發(fā)酵玫瑰醋發(fā)酵過程曲線

如圖2所示，補料分割發(fā)酵對玫瑰醋發(fā)酵過程中的還原糖、酒精度和總酸含量均有較明顯的影響。傳統(tǒng)玫瑰醋在發(fā)酵前一周左右的還原糖含量下降明顯，主要因為該階段酵母菌大量繁殖，分解還原糖產生酒精，酒精度最高可達到6%～7%vol[8]。另外，玫瑰醋還原糖含量隨補料分割的次數增多而降低，可能與補加的黃酒醪中無還原糖有關。由于黃酒醪中酒精含量較高，補料后的玫瑰醋中酒精含量在短時間內突增，反應物的增加促進反應速率，3次分割補料發(fā)酵缸中酒精消耗速率高于傳統(tǒng)對照組的0.055%vol/d，可達0.074%vol/d。酒精減少的同時，醋液中的酸度也會不斷上升，尤其在補料后，3次分割補料發(fā)酵缸中的總酸生成速率最高，可達到0.13 g/(dL·d)。并且，補料分割提高了玫瑰醋發(fā)酵中的總酒精含量，使得補料分割發(fā)酵缸的酸度比傳統(tǒng)對照組上升更快，其中3次分割補料發(fā)酵缸最高酸度為5.89 g/dL，高于傳統(tǒng)對照組的5.17 g/dL。1次分割補料補料量少，補加的酒精含量也相對較少，最終發(fā)酵酸度與傳統(tǒng)對照保持一致。

a-還原糖；b-酒精度；c-總酸圖2 玫瑰醋分割補料發(fā)酵過程中還原糖、酒精度和總酸含量的變化Fig.2 Changes of the content of reducing sugar, alcohol, and total acid in rosy vinegar during multiple divisions and feeding fermentation

2.2 多次補料分割發(fā)酵玫瑰醋有機酸含量比較

利用HPLC測定了玫瑰醋中乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、焦谷氨酸、酒石丙酮酸、草酸8種有機酸，結果如表1所示。相較于傳統(tǒng)發(fā)酵的玫瑰醋，分割補料發(fā)酵得到的玫瑰醋有機酸含量更高。

表1 傳統(tǒng)與分割補料發(fā)酵樣品有機酸含量 單位：g/LTable 1 Contents of organic acids in different samples

乙酸在玫瑰醋有機酸中占比在65%以上，是食醋酸味的主要來源。乳酸和琥珀酸也是有機酸的重要組成成分。玫瑰醋發(fā)酵前的浸米過程中，乳桿菌為主要微生物產生大量乳酸，同時“發(fā)花”培養(yǎng)的根霉、紅曲霉等霉菌也會生成乳酸[9]。相比傳統(tǒng)對照，分割補料發(fā)酵的玫瑰醋中乳酸含量有所提高，主要來源于補加的黃酒醪[10]，3次分割補料由于補料量最多，乳酸含量最高，達到(14.88±0.24)g/L。乳酸不僅能夠改善玫瑰醋的口感，還能緩解由乙酸帶來的刺激性[11]，在山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川保寧醋等固態(tài)發(fā)酵醋中，乳酸含量均高于浙江玫瑰醋[12]，因此通過分割補料發(fā)酵工藝有望改善傳統(tǒng)玫瑰醋風味。其他5種有機酸的總量占比低于1%。琥珀酸具有入口綿軟和酸而不澀的口感[13]，通過分割補料發(fā)酵可促進琥珀酸的累積，從而改善風味。其他5種有機酸的總量低于1%，也都能在山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋和四川保寧醋等名醋中檢測到[14]，這類有機酸多數是三羧酸循環(huán)過程的中間產物，也是參與其他代謝途徑的反應物。

醋酸桿菌屬能利用醋酸鹽及乳酸鹽使其氧化為CO2，因此發(fā)酵結束時需及時添加質量分數3%左右的食鹽結束發(fā)酵。加食鹽后，醋酸菌、乳酸菌等微生物的代謝作用迅速減弱，在相同條件下，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等代謝中間產物的積累跟添加食鹽前的發(fā)酵周期密切相關。傳統(tǒng)對照組發(fā)酵周期是傳統(tǒng)的90 d發(fā)酵+30 d后熟；1次補料分割發(fā)酵過程有補料使酸度降低→酸度回升的額外階段，發(fā)酵周期約延長1周，各種有機酸類代謝產物呈增加趨勢；3次補料分割發(fā)酵過程有補料使酸度降低→酸度回升的3個額外階段，發(fā)酵周期約延長3周，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等代謝中間產物得到進一步積累。

2.3 多次分割補料玫瑰醋揮發(fā)性成分比較

利用GC-MS方法分離鑒定玫瑰醋中揮發(fā)性成分，共檢測出57種化合物，包括酯類(32種)、醇類(9種)、酸類(7種)、酮類(5種)、醛類(4種)，各類成分含量如表2所示。

由圖3可以看出，分割補料對玫瑰醋中酯類物質含量影響最明顯。酯類是食醋中重要的呈香物質[15]，相比傳統(tǒng)發(fā)酵，3次分割補料中發(fā)酵缸中酯類積累最多，總量在3 605.74 mg/L。黃酒醪中富含氨基酸，而特定的氨基酸可以形成特定的高級醇，進而與酸生成酯[16]。其中乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯作為玫瑰醋主要酯類物質，使其帶有水果香的風味[17]。表2表明，3次分割補料中發(fā)酵缸中乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯含量分別提高了3倍和6倍以上。

表2 浙江玫瑰醋分割補料發(fā)酵結束揮發(fā)性成分含量 單位：mg/LTable 2 The volatile component content of rosy vinegar after multiple divisions and feeding fermentation

續(xù)表2

由圖3可知，除醇類和酸類外，玫瑰醋中第三大主要成分為醇類。醇類可以緩解乙酸帶來的刺激性。醇類中含量較高的為苯乙醇、異戊醇和乙醇。異戊醇具有水果香、酒精香和焦糖味[18]，是在支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸分解代謝或者在生物合成過程中形成[19]，為玫瑰醋提供特殊風味。相比于傳統(tǒng)玫瑰醋，異戊醇含量在3次分割補料中發(fā)酵缸中提高1倍以上，結果表明，乙醇和異戊醇作為黃酒中主要醇類[20]，通過補加黃酒醪可在一定程度上提高2種醇的含量。

圖3 傳統(tǒng)與分割補料發(fā)酵樣品的揮發(fā)性物質含量Fig.3 Content of volatile component in rosy vinegar under multiple divisions and feeding fermentation

發(fā)酵方式對玫瑰醋中酮類、醛類以及酚類物質含量影響不大，但較低的閾值對玫瑰醋特殊香氣的形成仍有一定貢獻[21]。其中，苯甲醛能增添玫瑰醋的甜味和香氣，3次分割補料中發(fā)酵缸中的苯甲醛含量是傳統(tǒng)對照組的3倍以上，這表明分割補料發(fā)酵在一定程度上能提高玫瑰醋的香氣。另外，2-甲氧基-4-甲基苯酚具有辛香、藥香、丁香、香莢蘭香氣，僅在傳統(tǒng)玫瑰醋和3次分割補料的發(fā)酵缸中檢測到，且含量較多。

2.4 多次補料分割發(fā)酵玫瑰醋得率色澤和感官比較

按4 g/dL標準對發(fā)酵結束的玫瑰醋進行稀釋換算，計算玫瑰醋得率。由表3可知，補料分割發(fā)酵玫瑰醋得率高于傳統(tǒng)發(fā)酵，且隨著分割次數的增多，得率越大。這是由于補料可以起到緩解產物抑制和避免代謝副產物積累的作用, 改善了微生物的培養(yǎng)環(huán)境, 有助于保持菌體活力的穩(wěn)定[22]。

表3 多次補料分割及傳統(tǒng)玫瑰醋得率比較Table 3 Yield of traditional rosy vinegar and multiple divisions and feeding fermentation

玫瑰醋色澤的形成主要來源于美拉德反應，由羰基化合物與氨基化合物相互作用，生成羥甲基糠醛等中間產物和焦糖化產物[23]。由圖4可知，半連續(xù)發(fā)酵工藝對于玫瑰醋色率有一定影響。發(fā)酵結束的傳統(tǒng)玫瑰醋色率可達到1.98×105，1次補料分割和3次補料分割色率分別為1.86×105和1.69×105，相比之下，分割次數越多，對于玫瑰醋色澤的影響越大。

圖4 半連續(xù)發(fā)酵玫瑰醋的色率Fig.4 Color ratio of rosy vinegar under multiple divisions and feeding fermentation

玫瑰醋感官評分如圖5所示，在大部分指標上補料分割發(fā)酵都略低于傳統(tǒng)發(fā)酵，除了澀味和酯香度。根據各指標分數圍成的面積作為各組玫瑰醋的最終總分：傳統(tǒng)發(fā)酵(99.72)>1次分割補料(91.88)>3次補料分割(88.01)?？梢姡指钛a料發(fā)酵玫瑰醋在感官上均略遜澀于傳統(tǒng)玫瑰醋，相差度為7.86%和11.74%，存在較小差異。

圖5 分割補料發(fā)酵玫瑰醋感官雷達圖Fig.5 Sensory radar map of rosy vinegar under multiple divisions and feeding fermentation

2.5 不用發(fā)酵方式玫瑰醋揮發(fā)性成分正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)

為進一步探究補料分割對玫瑰醋揮發(fā)性成分的影響，對傳統(tǒng)發(fā)酵、1次補料分割、3次分割補料以及深層醋揮發(fā)性成分進行OPLS-DA結果如圖6所示。

圖6 不同發(fā)酵方式玫瑰醋OPLS-DAFig.6 OPLS-DA of rosy vinegar with different fermentation methods

OPLS-DA結果表明，分割補料操作會對玫瑰醋中揮發(fā)性成分造成一定影響，但差異較小。通過變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)計算能夠衡量發(fā)酵方式對浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分的影響強度和解釋能力，通常以VIP值>1.0作為篩選標準。VIP值越大的揮發(fā)性成分，表明發(fā)酵方式對其含量差異影響越明顯。由圖7可以看出，VIP值>1的揮發(fā)性成分有乙酸異戊酯，乙酸苯乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、異戊醇、丙酸、乙酸、苯甲醛、乙酸異丁酯、苯乙醇、乙醇、3-羥基-2丁酮以及2-庚酮，表明分割補料發(fā)酵方式會對這些成分的含量造成較大影響。

圖7 揮發(fā)性成分VIP得分圖Fig.7 VIP values of volatile components注：橫坐標編號同表2

3 結論

本研究以黃酒醪對玫瑰醋進行多次分割補料，比較傳統(tǒng)發(fā)酵、1次分割補料、3次分割補料發(fā)酵生產玫瑰醋的品質差異。結果顯示，以酒精度為7%的黃酒發(fā)酵醪對玫瑰醋分別進行1次和3次補料分割發(fā)酵，發(fā)酵均順利完成，且獲得5.73%和6.08%的酸度，略高于對照組的5.71%。多次分割-補料發(fā)酵獲得的玫瑰醋樣品與傳統(tǒng)玫瑰醋有機酸的組成基本一致，且3次補料分割發(fā)酵缸的非揮發(fā)性有機酸含量均高于傳統(tǒng)玫瑰醋；多次補料發(fā)酵獲得的玫瑰醋樣品中主要揮發(fā)性成分比對照組均有所提升。在色澤和感官方面跟對照組比有所下降(10%～15%)，但總體上可以接受。因此，多次補料分割對于擴大玫瑰醋產量有一定的實際意義。OPLS-DA結果表明補料分割發(fā)酵對玫瑰醋揮發(fā)性成分影響較小，乙酸異戊酯，乙酸苯乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、異戊醇、丙酸、乙酸、苯甲醛、乙酸異丁酯、苯乙醇、乙醇、3-羥基-2丁酮以及2-庚酮是主要差異成分物質。