潘斐，朱逸凡，嚴(yán)一凡，杜姍姍，李莎，徐虹，羅正山,3*

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211816)2(南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，211816)3(南京軒凱生物科技股份有限公司，江蘇 南京，211816)

血紅素作為一種含鐵卟啉化合物，廣泛存在于各種生物體中[1]，其對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)后修飾等起著一定的調(diào)控作用[2-3]。這些生理功能使其在食品、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。隨著市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，當(dāng)前通過動(dòng)植物提取法獲得的血紅素已無法滿足日益增加的應(yīng)用需求。此外，動(dòng)植物提取法存在原料來源有限且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。利用合成生物學(xué)技術(shù)理性設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，以廉價(jià)生物質(zhì)為底物發(fā)酵生產(chǎn)血紅素是近來的研究熱點(diǎn)，且該方法具有價(jià)格低廉、產(chǎn)物純度高和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，被寄予厚望。

近年來，隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，研究人員已成功實(shí)現(xiàn)多種生物基化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)，如丙酮酸、聚谷氨酸等[5-7]。在血紅素的生物合成方面，研究人員通過優(yōu)化C4和C5途徑來合成血紅素取得了一定的成果，但是存在一些不足。KWON等[8]通過在大腸桿菌中構(gòu)建C4途徑以及優(yōu)化胞內(nèi)代謝流，實(shí)現(xiàn)了血紅素的合成，但發(fā)現(xiàn)C4途徑合成血紅素的效率非常低。此外，ZHAO等[9]在大腸桿菌中通過理性優(yōu)化C5合成途徑、調(diào)控血紅素合成的下游途徑、補(bǔ)加合成前體等策略，顯著改善了血紅素的積累，并發(fā)現(xiàn)C5途徑合成血紅素的效率明顯高于C4途徑，但獲得血紅素合成的底物轉(zhuǎn)化率僅為0.000 138 mol/mol(血紅素/葡萄糖)，遠(yuǎn)低于理論轉(zhuǎn)化率。因此，如何提升C5途徑合成血紅素的底物轉(zhuǎn)化率是下一步研究的重點(diǎn)。與大多數(shù)天然產(chǎn)物合成途徑一樣，血紅素的生物合成途徑非常長(zhǎng)且涉及到28個(gè)途徑基因(從葡萄糖到合成血紅素)。目前，幾乎所有血紅素生物合成研究都是采用多個(gè)質(zhì)粒在一個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)合成途徑基因的策略，這會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。為避免在單一宿主細(xì)胞中設(shè)計(jì)天然產(chǎn)物合成途徑造成的胞內(nèi)代謝流紊亂和細(xì)胞代謝壓力增高等問題，共培養(yǎng)體系設(shè)計(jì)策略被提出并用于構(gòu)建細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成平衡、無有毒中間代謝產(chǎn)物累積、生產(chǎn)效率顯著提高的細(xì)胞工廠，取得了令人矚目的成績(jī)[10-11]。例如，ZHOU等[12]將紫杉醇前體的合成途徑分為2個(gè)模塊，分別構(gòu)建在釀酒酵母和大腸桿菌中，通過進(jìn)一步的途徑優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了紫杉醇前體的高效合成。

本課題組前期研究獲得了1株谷氨酸非依賴性高產(chǎn)聚谷氨酸的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) NX-2S154，該菌株具有較高的三羧酸循環(huán)代謝通量和谷氨酸合成代謝流。此外，對(duì)該菌株的代謝途徑進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)和優(yōu)化后，實(shí)現(xiàn)了其利用葡萄糖等碳源高效合成聚谷氨酸等產(chǎn)品[13-15]。B.amyloliquefaciensNX-2S154菌株的這些特點(diǎn)為理性設(shè)計(jì)C5途徑合成血紅素的研究提供了一個(gè)難得的底盤菌株。本研究以具有高谷氨酸合成代謝通量的解淀粉芽孢桿菌NX-2S154和具有異源酶高表達(dá)能力的大腸桿菌BL21為出發(fā)菌株，通過將血紅素的合成途徑分為前體5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)合成模塊和5-ALA合成血紅素模塊，分別理性設(shè)計(jì)在解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌中構(gòu)建血紅素生物合成的共培養(yǎng)體系，并對(duì)獲得的共培養(yǎng)體系進(jìn)行進(jìn)一步的代謝途徑設(shè)計(jì)和過程優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了血紅素的合成，以期提高菌株發(fā)酵的底物轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌NX-2S154以及大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，大腸桿菌GM2163用于質(zhì)粒的去甲基化。本研究所用菌株與質(zhì)粒詳見表1，質(zhì)粒構(gòu)建所有引物詳見表2。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 本研究所使用引物Table 2 Primers used in the study

續(xù)表2

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、壯觀霉素，上海麥克林生化科技有限公司；基因組抽提試劑盒、2×Phanta Max Master Mix、One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；谷氨酸檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；酵母粉、蛋白胨，OXOID公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉10，蛋白胨5，(NH4)2SO415，Na2HPO4·12H2O 10,KH2PO42,FeSO4·7H2O 0.05。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵方法

5-ALA搖瓶發(fā)酵：發(fā)酵種子液培養(yǎng)12 h后以1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵周期為54 h，定時(shí)取樣。

血紅素共培養(yǎng)體系搖瓶發(fā)酵：分別單獨(dú)培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌菌株與大腸桿菌的發(fā)酵種子液12 h，各以1%的接種量轉(zhuǎn)接于含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，于32 ℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)3 h，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，定時(shí)取樣測(cè)定共培養(yǎng)體系中的血紅素和生物量等。

7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：發(fā)酵罐中裝液量為3 L，解淀粉芽孢桿菌工程菌株與大腸桿菌工程菌株種子液分別培養(yǎng)12 h，各以1%的接種量同時(shí)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵條件為32 ℃，400 r/min，通氣量為1 vvm，共培養(yǎng)3 h后加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)并定時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)發(fā)酵參數(shù)。

1.2.2 轉(zhuǎn)化方法

參考SHA等[13]的解淀粉芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

1.2.3 基因敲除與載體構(gòu)建

利用QIU等[16]報(bào)道的CRISPR-cas9n基因組編輯技術(shù)對(duì)解淀粉芽孢桿菌的基因組DNA進(jìn)行編輯。以敲除聚谷氨酸合酶基因pgsBCA為例，流程如下：以解淀粉芽孢桿菌基因組為模板，利用引物sgpgsBCA-F/R、pgsBCA-UP-F/R和pgsBCA-DN-F/R分別通過擴(kuò)增得到crRNA-tracRNA、UPgene和DNgene基因片段。將上述基因片段通過重疊PCR進(jìn)行連接，獲得crRNA-tracRNA-UPgene-DNgene片段，接著，將上述片段組裝到線性化的pDR244載體上，獲得重組質(zhì)粒pDR-sgpgsBCA。將pDR-sgpgsBCA以及pHT01-cas9n質(zhì)粒(先前研究構(gòu)建[16])同時(shí)轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌中。通過平板篩選和菌落PCR獲得正確的陽(yáng)性克隆子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基中，并加入IPTG誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)，利用PCR技術(shù)驗(yàn)證目的基因是否敲除成功。同樣，利用上述方法對(duì)解淀粉芽孢桿菌的prob、nas、ldh和pta基因進(jìn)行敲除以構(gòu)建不同工程菌株。

基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程：以大腸桿菌MG1655基因組為模板，利用引物gltX1-F/R、hemA1-F/R和hemL1-F/R分別通過PCR擴(kuò)增獲得gltX、hemA、hemL基因片段，之后通過重疊PCR連接上述基因片段，獲得gltX-hemA-hemL多基因片段。將gltX-hemA-hemL基因片段與線性化pMA5載體進(jìn)行組裝，構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的解淀粉芽孢桿菌中，獲得目的基因表達(dá)的工程菌株。此外，利用表2所示引物從大腸桿菌基因組上擴(kuò)增獲得hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH基因片段并按照上述質(zhì)粒構(gòu)建方法將其組裝到pRSF-Duet1中，獲得質(zhì)粒pRSF Duet1-hemBCDEFGH。從大腸桿菌以及解淀粉芽孢桿菌基因組上擴(kuò)增出不同來源gltX、hemA、hemL基因片段，通過重疊PCR進(jìn)行連接，獲得不同組合的gltX、hemA、hemL多基因片段。將不同組合的gltX-hemA-hemL基因片段與pMA5載體組裝，獲得不同的gltX、hemA、hemL表達(dá)質(zhì)粒。以大腸桿菌基因組為模板，擴(kuò)增獲得rhtA以及ccmABC基因片段，將上述片段組裝到相關(guān)的質(zhì)粒上，獲得表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.4 5-ALA與血紅素檢測(cè)方法

參考TAN等[17]的化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)5-ALA;參考ZHAO等[9]的液相檢測(cè)方法檢測(cè)血紅素。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建血紅素生物合成的共培養(yǎng)體系

前體供應(yīng)對(duì)于微生物細(xì)胞工廠合成目標(biāo)產(chǎn)物至關(guān)重要[18]。谷氨酸作為血紅素合成的前體，其胞內(nèi)水平將在很大程度上影響血紅素的合成。為了驗(yàn)證B.amyloliquefaciensNX-2S154在血紅素生物合成過程中能否提供充足谷氨酸前體。首先，利用CRISPR-cas9n技術(shù)敲除B.amyloliquefaciensNX-2S154中編碼聚谷氨酸合酶的基因pgsBCA，獲得工程菌株B.amy-0(NX-2S154ΔpgsBCA)。接著，將出發(fā)菌B.amyloliquefaciensNX-2S154與工程菌株B.amy-0分別在LB平板上劃線培養(yǎng)。通過對(duì)這2株菌株的菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在敲除pgsBCA基因后，菌落形態(tài)由飽滿濕潤(rùn)變得扁平且十分干燥(圖1-a、圖1-b)。通過對(duì)上述2株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵來驗(yàn)證聚谷氨酸合酶基因敲除前后的胞內(nèi)谷氨酸含量以及菌株生長(zhǎng)情況。由圖1-c可知，工程菌株B.amy-0的OD600達(dá)到7.84，與原始菌株相比提升12.90%。此外，通過測(cè)定B.amyloliquefaciensNX-2S154以及B.amy-0菌株的胞內(nèi)谷氨酸含量，發(fā)現(xiàn)B.amy-0菌株的胞內(nèi)谷氨酸含量達(dá)到674.67 μg/g，相對(duì)于原始菌株(75.64 μg/g)提升了791.94%。這些結(jié)果充分說明B.amy-0菌株具有高效的胞內(nèi)谷氨酸合成通量，可為血紅素合成的共培養(yǎng)體系提供充足谷氨酸前體。

a-NX-2S154菌落形態(tài)；b-NX-2S154ΔpgsBCA菌落形態(tài)；c-聚谷氨酸合酶基因敲除前后菌株生長(zhǎng)情況及胞內(nèi)谷氨酸濃度圖1 NX-2S154與NX-2S154ΔpgsBCA菌落形態(tài)及發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)量Fig.1 The NX-2S154 and NX-2S154ΔpgsBCA colony morphology and fermentation metabolite yield

以葡萄糖為底物合成血紅素涉及到28個(gè)的途徑酶。如將這些途徑基因全部過表達(dá)于單個(gè)宿主細(xì)胞中將會(huì)嚴(yán)重影響菌株的胞內(nèi)代謝流平衡。因此，我們將血紅素的合成途徑分為前體5-ALA合成模塊和5-ALA合成血紅素模塊，分別構(gòu)建于解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌中。在解淀粉芽孢桿菌中異源表達(dá)大腸桿菌來源的gltX，hemA和hemL基因構(gòu)建前體5-ALA合成模塊，獲得工程菌株B.amy-1[NX-2S154ΔpgsBCA(pMA5-gltXE.coli-hemAE.coli-hemAE.coli)]。由圖2-a可知，工程菌株B.amy-1在發(fā)酵過程中5-ALA的積累量不斷增加，達(dá)到136.81 mg/L。而對(duì)照菌株B.amy-0僅存在微量的本底表達(dá)(約1.45 mg/L)。同時(shí)，在大腸桿菌中異源表達(dá)大腸桿菌來源的hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH基因構(gòu)建血紅素合成模塊，獲得工程菌株E.coli-a。將工程菌株B.amy-1和E.coli-a進(jìn)行血紅素的共培養(yǎng)發(fā)酵，獲得7.84 mg/L的血紅素積累。此時(shí)，共培養(yǎng)體系的5-ALA質(zhì)量濃度相對(duì)較低，僅為76.62 mg/L，較B.amy-1菌株下降了43.99%(圖2-b)。

a-B.amy-1工程菌株發(fā)酵過程中5-ALA產(chǎn)量；b-共培養(yǎng)體系發(fā)酵過程中5-ALA和血紅素產(chǎn)量圖2 B.amy-1工程菌株以及共培養(yǎng)體系發(fā)酵參數(shù)Fig.2 Fermentation parameters of co-cultivation system and B.amy-1 engineering strain

2.2 代謝工程優(yōu)化共培養(yǎng)體系改善血紅素合成

為了提高上述共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，需要采取組合多種代謝工程策略對(duì)共培養(yǎng)體系進(jìn)行進(jìn)一步的代謝途徑優(yōu)化。首先，通過對(duì)不同宿主來源的5-ALA途徑基因gltX、hemA、hemL進(jìn)行基因表達(dá)的適配性優(yōu)化，獲得8種含有不同基因組合的工程菌株。這些工程菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明工程菌株B.amy-2[NX-2S154ΔpgsBCA(pMA5-gltXB.Amy-hemAB.Amy-hemLE.coli)]的5-ALA產(chǎn)量提升最為明顯，其5-ALA積累量達(dá)到298.72 mg/L，較對(duì)照菌株B.amy-1(136.8 mg/L)菌株提升了118.3%(圖3)。因此，菌株B.amy-2將作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

圖3 不同來源5-ALA途徑基因組合的產(chǎn)量Fig.3 Titer of 5-ALA pathway gene combinations from different sources

阻斷目標(biāo)產(chǎn)物合成的競(jìng)爭(zhēng)代謝通路是改善目標(biāo)產(chǎn)物合成效率的一種高效策略[19]。為了改善共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，利用CRISPR-cas9n技術(shù)分別敲除B.amy-2菌株的ldh、pta、nas以及prob基因來阻斷副產(chǎn)物乳酸、乙酸、N-乙酰氨基谷氨酸以及脯氨酸的生物合成，獲得B.amy-3、B.amy-4、B.amy-5和B.amy-6工程菌株。這些菌株的搖瓶發(fā)酵的5-ALA積累水平相對(duì)于B.amy-2菌株分別提升32.47%、29.40%、42.03%和6.01%(圖4-a～圖4-d)。

a-敲除ldh基因?qū)晟L(zhǎng)和5-ALA濃度的影響；b-敲除pta基因?qū)晟L(zhǎng)和5-ALA濃度的影響；c-敲除nas基因?qū)晟L(zhǎng)和5-ALA濃度的影響；d-敲除prob基因?qū)晟L(zhǎng)和5-ALA濃度的影響；e-敲除4個(gè)旁路基因?qū)晟L(zhǎng)和5-ALA濃度的影響；f-敲除4個(gè)旁路基因?qū)才囵B(yǎng)體系的影響圖4 敲除旁路基因?qū)晟L(zhǎng)、5-ALA以及共培養(yǎng)體系的影響Fig.4 Effects of knockout bypass genes on strain growth, 5-ALA, and co-culture systems

其中，敲除解淀粉芽孢桿菌的nas基因使得5-ALA產(chǎn)量提升最明顯，達(dá)到424.26 mg/L。接著，為了進(jìn)一步改善解淀粉芽孢桿菌合成5-ALA的能力，在B.amy-2菌株中同時(shí)敲除上述4個(gè)旁路基因獲得了B.amy-7工程菌株，該菌株搖瓶發(fā)酵5-ALA的產(chǎn)量達(dá)到524.26 mg/L，較B.amy-2菌株(298.72 mg/L)提高了75.50%(圖4-e)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明阻斷5-ALA和血紅素生物合成的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑對(duì)改善前體5-ALA的合成至關(guān)重要。最后，將工程菌株B.amy-7與E.coli-a菌株進(jìn)行血紅素的共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中血紅素的產(chǎn)量達(dá)到18.16 mg/L，相比于阻斷副產(chǎn)物合成途徑之前提高了131.62%。此外，工程菌株B.amy-7與E.coli-a的發(fā)酵體系中5-ALA的積累量為185.72 mg/L，較B.amy-7單獨(dú)發(fā)酵下降了64.57%(圖4-f)。

為加速共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌的胞內(nèi)5-ALA向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入大腸桿菌的效率，避免5-ALA胞內(nèi)積累對(duì)5-ALA生物合成途徑的反饋抑制，在工程菌株B.amy-7中表達(dá)rhtA基因來構(gòu)建5-ALA胞外轉(zhuǎn)運(yùn)通路，獲得工程菌株B.amy-8。通過對(duì)工程菌株B.amy-8和E.coli-a進(jìn)行血紅素共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)化5-ALA胞外轉(zhuǎn)運(yùn)后，共培養(yǎng)體系中5-ALA的積累量較B.amy-7與E.coli-a的共培養(yǎng)體系有所降低，并且共培養(yǎng)體系中血紅素含量提升了16.91%，達(dá)到21.23 mg/L(圖5)。

圖5 構(gòu)建5-ALA胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)共培養(yǎng)體系的影響Fig.5 Effects of constructing 5-ALA extracellular transporter on co-culture system

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑設(shè)計(jì)強(qiáng)化血紅素的合成

血紅素的胞內(nèi)合成受到嚴(yán)格調(diào)控，為減少血紅素胞內(nèi)積累對(duì)其生物合成途徑關(guān)鍵酶的反饋抑制，在E.coli-a菌株中過表達(dá)編碼血紅素胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ccmABC基因構(gòu)建血紅素的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)通路，獲得E.coli-b工程菌株。工程菌株B.amy-8與E.coli-b的共培養(yǎng)發(fā)酵結(jié)果表明構(gòu)建血紅素胞外轉(zhuǎn)運(yùn)通路使得血紅素的積累量提高了34.02%，達(dá)到28.36 mg/L，其中胞外血紅素濃度達(dá)到14.94 mg/L(圖6)。

圖6 表達(dá)血紅素胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì) 5-ALA以及胞內(nèi)、胞外血紅素濃度的影響Fig.6 Effects of expression of heme extracellular transporter on 5-ALA and intracellular and extracellular heme concentration

通過對(duì)共培養(yǎng)體系進(jìn)行多種代謝工程改造后，解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力得到了不斷提升，相對(duì)于優(yōu)化前的共培養(yǎng)體系，血紅素的產(chǎn)量提升了2.62倍(表3)。

表3 本研究所獲工程菌株和共培養(yǎng)體系合成5-ALA與血紅素的產(chǎn)量比較Table 3 Titer of 5-ALA and heme in the engineering strains and the co-cultivation system obtained in this study

續(xù)表3

2.4 7.5 L發(fā)酵罐分批及分批補(bǔ)料發(fā)酵

為了提升上述共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，將B.amy-8與E.coli-b的共培養(yǎng)體系在7.5 L發(fā)酵罐進(jìn)行血紅素的分批發(fā)酵，其5-ALA和血紅素產(chǎn)量分別達(dá)到168.48 mg/L與36.31 mg/L，與搖瓶發(fā)酵相比分別提升了2.45%和28.03%(圖7-a)。

a-分批發(fā)酵；b-分批補(bǔ)料發(fā)酵圖7 共培養(yǎng)體系發(fā)酵參數(shù)Fig.7 Parameters of co-culture systems

此外，有文獻(xiàn)報(bào)道在發(fā)酵初期過高的葡萄糖濃度會(huì)導(dǎo)致乙酸等副產(chǎn)物的積累從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]。為了提高發(fā)酵過程中菌體密度以及目標(biāo)產(chǎn)物的合成，分批補(bǔ)料發(fā)酵策略被采用。首先將初始葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為20 g/L，并在發(fā)酵12、24和36 h分別流加10 g/L的葡萄糖。由圖7-b可知，在補(bǔ)料發(fā)酵過程中，共培養(yǎng)體系的菌株生長(zhǎng)迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并且在48 h菌株的OD600達(dá)到最高。血紅素的積累量達(dá)到65.38 mg/L，相對(duì)于分批發(fā)酵提升1.8倍。

3 討論與結(jié)論

本研究以B.amyloliquefaciensNX-2S154和E.coliBL21為出發(fā)菌株構(gòu)建血紅素合成的共培養(yǎng)體系，獲得了7.84 mg/L的血紅素積累。通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌中合成5-ALA的關(guān)鍵途徑基因進(jìn)行適配性優(yōu)化，并敲除多個(gè)副產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵基因?qū)崿F(xiàn)了碳代謝流高效流向血紅素，使得血紅素的產(chǎn)量達(dá)到18.16 mg/L，相比于優(yōu)化前提高了131.62%。此外，通過載體工程策略構(gòu)建5-ALA與血紅素的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)通路，獲得了28.36 mg/L的血紅素。最后，在7.5 L發(fā)酵罐進(jìn)行血紅素的分批與分批補(bǔ)料發(fā)酵，使得血紅素的產(chǎn)量達(dá)到65.38 mg/L。

本研究雖然首次采用共培養(yǎng)體系實(shí)現(xiàn)血紅素的生物合成，但目前血紅素的產(chǎn)量及其轉(zhuǎn)化率仍然相對(duì)較低。因此，后續(xù)可能需要進(jìn)一步開展以下研究工作來進(jìn)一步改善血紅素合成效率。首先，開發(fā)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)來理性調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，提高代謝流流向血紅素生物合成的效率[21]。其次，血紅素的生物合成受到嚴(yán)格調(diào)控，需要研究血紅素對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制機(jī)制，并通過蛋白質(zhì)工程手段緩解反饋抑制作用。另外，需要探索血紅素共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌之間的信息交流以及物質(zhì)交換機(jī)制，為構(gòu)建上述菌株共培養(yǎng)體系高效合成血紅素及其他產(chǎn)物提供新的研究方向[22]。