崔瑋琪

(濱州市海洋發(fā)展研究院，山東濱州 256600)

弧菌(Vibrio)是海水養(yǎng)殖中比較常見的致病菌之一，發(fā)病率高，危害性較大，尤其是對蝦育苗期，感染后會出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象[1，2]。有研究發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌是導(dǎo)致對蝦急性肝胰腺壞死病(Ahpnd)的主要病原體，被感染后的對蝦會出現(xiàn)生長緩慢、運(yùn)動無力、中腸及肝胰腺蒼腺蒼白等癥狀[3-6]，因此弧菌嚴(yán)重制約這對蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。文章從患病的凡納濱對蝦養(yǎng)殖池的水樣中分離出病原菌株并對菌株進(jìn)行鑒定，以期為對蝦養(yǎng)殖中疫病防控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)水樣

試驗(yàn)水樣來自濱州市博興縣某育苗廠的4個健康無病害的凡納濱對蝦的養(yǎng)殖池，每個池塘內(nèi)選取了5個不同采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)取20mL水樣，將所有水樣混合均勻。

1.2 菌株分離、純化

1.2.1 初篩

在超凈工作臺內(nèi)，取混合后的水樣100uL均勻涂布于TCBS固體瓊脂培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)24 hrs[7]，觀察菌落形態(tài)。將培養(yǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行劃線純化，再挑取單菌落接種到TSB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)[8]。

1.2.2 菌株的生理生化鑒定

形態(tài)特征：挑取TCBS培養(yǎng)基上的藍(lán)綠色單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

生化鑒定：主要包括葡萄糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、阿拉伯糖發(fā)酵、鼠李糖發(fā)酵、4℃生長、42℃生長、氧化酶、蔗糖發(fā)酵、接觸酶、葡萄糖產(chǎn)氣、0% NaCl生長、2%NaCl生長、5%NaCl生長、7% NaCl生長、10% NaCl生長、吲哚產(chǎn)生、V.P.反應(yīng)、甲基紅。

參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》[9]和《伯杰氏鑒定細(xì)菌手冊》判斷細(xì)菌種類。

1.2.3 16S rDNA基因序列分析

采用TaKaRa試劑公司的DNA提取試劑盒提取單組菌落DNA，將提取得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃時5mins，94℃時1min，55℃時1min，72℃時90s?？傆嬤M(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃時10mins。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(濟(jì)南)股份有限公司測序。應(yīng)用BLAST軟件將所得到的序列與GenBank中有關(guān)序列進(jìn)行同源性分析，選取同源性高的序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 生長曲線的測定

將篩選得到的菌種進(jìn)行37℃液體搖床培養(yǎng)，從接種開始每隔2hrs取樣一次，在560nm下測定菌液的OD值。繪制OD值和培養(yǎng)時間的關(guān)系圖。

2 浸染試驗(yàn)

2.1 攻毒實(shí)驗(yàn)對象及條件

采用濱州市某養(yǎng)殖場體長約3cm左右的健康的凡納濱為試驗(yàn)對象，正式試驗(yàn)開始前，將凡納濱對蝦放在pH8.0，連續(xù)充氣塑料桶內(nèi)暫養(yǎng)4d，配合飼料飽食投喂。養(yǎng)殖水體鹽度為19‰，水溫為26℃，隨后將凡納濱對蝦隨機(jī)分組，每組為30尾。在浸染試驗(yàn)前所有試驗(yàn)組對蝦需禁食1d。

2.2 供試菌株

將純化后的菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基上，28℃搖床培養(yǎng)20hrs，560nm(OD 560nm)比濁測定后備用。

2.3 浸浴攻毒實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)立5個處理組和一個對照組。將活化的ZH-1菌液 [104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL和108cfu/mL] 300mL分別加入20L的水體中，浸泡30尾試驗(yàn)的凡納濱對蝦，同時設(shè)同體積的無菌生理鹽水作為實(shí)驗(yàn)對照，每組設(shè)置3個平行。每天觀察凡納濱對蝦的發(fā)病與死亡情況，實(shí)驗(yàn)周期為7d。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 病原菌的分離

從來自不同苗池的3株菌株，選擇其中1株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，編號為ZH-1。

3.2 病原菌的鑒定

3.2.1 鏡檢

ZH-1經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察為陰性菌，形狀為短桿狀、兩端鈍圓，分散排列，邊緣圓形，略微隆起，渾濁，呈綠色，在2216E培養(yǎng)基上菌落呈擴(kuò)展?fàn)?，大小不?guī)則，不透明，濕潤，淺綠色。

3.2.2 生化試驗(yàn)

對分離株做生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 ZH-1的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characterization of ZH-1 strain

3.3 16S rDNA測定

采用16S rDNA測定后，獲得圖1結(jié)果：

圖1 病原菌16S rDNA基因序列

圖2 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

3.4 分離株生長曲線的測定

如圖3所示，菌株ZH-1在培養(yǎng)6hrs的時候開始進(jìn)入了對數(shù)生長期，在22hrs時達(dá)到了對數(shù)期的最高值，隨后進(jìn)入了穩(wěn)定期，28hrs后開始進(jìn)入衰亡期。

圖3 ZH-1的生長曲線Fig.3 the growth curve of ZH-1

3.5 凡納濱對蝦浸染攻毒試驗(yàn)結(jié)果

取健康的凡納濱對蝦，驗(yàn)證菌株ZH-1的致病性。試驗(yàn)結(jié)果表明：濃度分別為1.0×104cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×107cfu/mL、1.0×108cfu/mL時，浸浴4d后死亡率分別為100%、76.7%、40.0%、6.67%，而對照組沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。經(jīng)過計算菌株ZH-1對凡納濱對蝦的半數(shù)致死濃度為1.12×106cfu/mL。

表2 菌株ZH-1對凡納濱對蝦人工浸浴感染半致死試驗(yàn)Tab.2 LC50 test of pathogenic strian ZH-1 against Litopenaeus vannamei

4 討論

副溶血弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的主要病原菌，是急性肝胰腺壞死病的主要病原體，感染后的對蝦會出現(xiàn)生長緩慢、乏力、肝胰腺及腸發(fā)白等癥狀[4，5，9]。樊景鳳、張曉君等報道過凡納濱對蝦被副溶血弧菌感染后會出現(xiàn)紅體的現(xiàn)象，該研究中使用菌株ZH-1感染凡納濱對蝦后不僅出現(xiàn)附肢發(fā)紅，肝胰腺出現(xiàn)腫大。人工浸浴感染實(shí)驗(yàn)證明菌株ZH-1感染性較強(qiáng)，菌株濃度在1.0×107cfu/mL時會造成76.7%的對蝦死亡。

近年來，弧菌作為對凡納濱對蝦養(yǎng)殖場的危害出現(xiàn)了逐年嚴(yán)重的趨勢，因此養(yǎng)殖戶要引起足夠的重視，提高防控意識。一要保證做每次進(jìn)水需要消毒，為對蝦生長提供良好的水環(huán)境；二要做到及時跟蹤監(jiān)測養(yǎng)殖池內(nèi)的水質(zhì)環(huán)境，防止弧菌的大量繁殖和傳播；三要定時監(jiān)測水體和蝦體內(nèi)弧菌情況；三是可以投喂一些益生菌，例如乳酸菌、酵母菌等，在腸道內(nèi)形成優(yōu)勢菌群，抑制腸道內(nèi)弧菌的繁殖。