王 新，左 文*，胡書群，周艷麗，韓 嬌

0 引言

乳腺癌作為常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1]。目前，乳腺癌的主要治療方法以手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療為主，近年來，一些生物或免疫療法也逐漸應(yīng)用于臨床[2-3]。但獲得性耐藥的出現(xiàn)往往導(dǎo)致化學(xué)或生物藥物治療失敗。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是乳腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤的一線化療藥物，其通過促進(jìn)微管聚合，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。由于PTX有著確切的療效和安全性，自發(fā)現(xiàn)至今一直被臨床廣泛應(yīng)用。但許多中晚期患者經(jīng)過一定療程的PTX治療后易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。因此，解決PTX耐藥具有重要的臨床意義。

微小RNA(miRNA)是近年來的研究熱點之一，miRNA能通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并指導(dǎo)降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯[5]。研究顯示，miRNA在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，如惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾病等[6]。微小RNA-1246(miR-1246)是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，是多種惡性腫瘤，如乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]等的潛在診斷標(biāo)志物。已有研究顯示，miR-1246能夠靶向 CyclinG2調(diào)控乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和化療耐藥[10]。但有關(guān)miR-1246與乳腺癌化療耐藥的報道還很有限，miR-1246的相關(guān)耐藥機制還不明確，有待更多研究探討。本研究通過構(gòu)建PTX耐藥乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3/PTX，觀察miR-1246在SK-BR-3/PTX中的作用和相關(guān)作用機制，為解決乳腺癌PTX耐藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和藥物 人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3購自北納生物；PTX(批號：1A00551)購自美國Sigma公司。

1.2 主要試劑和儀器 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)購自美國MedChemExpress公司； Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒、RIPA總蛋白提取試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒和GAPDH抗體購自北京索萊寶公司；RNAiso for Small RNA試劑盒、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒和引物購自北京寶日醫(yī)生物；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、LaminB、P-gp一抗、抗兔IgG-HRP二抗及熒光二抗均購自美國CST公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)購自美國Gibco公司；miR-1246 inhibitor轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉凱基因公司。SpectraMax M5/M5e多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，Leica DMi8倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司，ABI 7500型定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和耐藥細(xì)胞誘導(dǎo) SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。PTX耐藥SK-BR-3細(xì)胞(SK-BR-3/PTX)采用逐漸增加PTX藥物濃度(0.1～500 nmol/L)方法誘導(dǎo)，經(jīng)過4個月成功獲得一株耐藥細(xì)胞。

1.3.2 miR-1246 inhibitor轉(zhuǎn)染 將miR-1246 inhibitor和對照 inhibitor(NC inhibitor)粉末用RNase-free water配制成20 μmol/L的母液備用。將對數(shù)期SK-BR-3/PTX細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板。次日，配制分別含200 nmol/L miR-1246 inhibitor和NC inhibitor的DMEM高糖培養(yǎng)基，用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體2000。將含inhibitor和脂質(zhì)體2000的培養(yǎng)基混合，室溫靜置20 min。混合物分別加入細(xì)胞中，分別作為miR-1246 inhibitor組和NC inhibitor組，再加入1 ml DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以RT-qPCR對miR-1246表達(dá)進(jìn)行驗證。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將對數(shù)期SK-BR-3細(xì)胞和 SK-BR-3/PTX細(xì)胞按8×103個/孔分別接種于96孔板，每組5個重復(fù)孔，SK-BR-3細(xì)胞以0.1、1、10、100、1 000 nmol/L PTX處理48 h，SK-BR-3/PTX細(xì)胞以10、100、500、1 000、5 000、10 000 nmol/L PTX處理48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱3 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測細(xì)胞miR-1246表達(dá) 細(xì)胞以RNAiso for Small RNA試劑盒提取總Small RNA，參考說明書以Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒和引物進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參，2(-△△Ct )法計算miR-1246表達(dá)水平。miR-1246正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3′；miR-1246反向引物：5′-ACTGACTGATGCAATCTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6正向引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；U6反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.3.5 免疫熒光實驗檢測細(xì)胞P-gp表達(dá) 將蓋玻片置于6孔板中，以5×105個/孔分別接種SK-BR-3細(xì)胞和 SK-BR-3/PTX細(xì)胞，24 h后PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，再以Triton X-100通透10 min。取出蓋玻片，滴加含5%牛血清白蛋白的PBS溶液封閉2 h。滴加P-gp抗體(1∶300)于4 ℃孵育過夜。PBST洗去一抗，滴加熒光二抗(1∶250)于黑盒內(nèi)室溫孵育1 h。洗去二抗，DAPI染色5 min，洗去DAPI，抗熒光猝滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 Western blot法檢測p-NF-κB p65、IκBα和P-gp蛋白表達(dá) 用RIPA試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白。提取的蛋白以增強型BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量并制備蛋白上樣樣品。蛋白按25 μg/孔采用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離。進(jìn)一步將凝膠上分離好的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5% BSA封閉PVDF膜2 h，4 ℃孵育NF-κB p65(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶800)、IκBα(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)、LaminB(1∶2 000)或P-gp(1∶2 000)抗體過夜。TBST 洗去一抗，室溫避光孵育抗兔IgG-HRP二抗(1∶4 000)1 h，TBST 洗去二抗。PVDF膜表面淋SuperSignal化學(xué)發(fā)光液，于凝膠成像系統(tǒng)下成像。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將NC inhibitor和miR-1246 inhibitor細(xì)胞以PTX(5 nmol/L)處理48 h，設(shè)為NC inhibitor+PTX組和miR-1246 inhibitor+PTX組；同時用1‰體積蓖麻油(PTX溶劑)處理NC inhibitor作為對照，設(shè)為NC inhibitor。PTX處理結(jié)束后，用Annexin V/PI試劑盒于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 miR-1246在SK-BR-3/PTX細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) CCK-8檢測活力，經(jīng)計算PTX對SK-BR-3細(xì)胞的IC50為(45.2±3.9)nmol/L，對SK-BR-3/PTX細(xì)胞的IC50為(2 317.6±188.6)nmol/L，SK-BR-3/PTX細(xì)胞耐藥指數(shù)為51.3。與SK-BR-3細(xì)胞相比，PTX對SK-BR-3/PTX細(xì)胞的IC50顯著升高(P<0.01，圖1A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與SK-BR-3細(xì)胞相比，SK-BR-3/PTX細(xì)胞miR-1246表達(dá)水平顯著升高(P<0.01，圖1B)。

圖1 SK-BR-3/PTX細(xì)胞的構(gòu)建及miR-1246表達(dá)水平檢測

2.2 P-gp蛋白在SK-BR-3/PTX細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) Western blot結(jié)果顯示，與SK-BR-3細(xì)胞相比，SK-BR-3/PTX細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01，圖2A)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示，SK-BR-3細(xì)胞和SK-BR-3/PTX細(xì)胞P-gp熒光染色的IOD值分別為(2 358.6±200.8)和(93 689.5±7 056.2)，與SK-BR-3細(xì)胞相比，SK-BR-3/PTX細(xì)胞P-gp熒光染色的IOD值顯著升高(P<0.01，圖2B)。

圖2 SK-BR-3和SK-BR-3/PTX細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)情況

2.3 SK-BR-3/PTX細(xì)胞NF-κB通路活性增強 Western blot結(jié)果顯示，與SK-BR-3細(xì)胞相比，SK-BR-3/PTX細(xì)胞總蛋白p-NF-κB p65蛋白顯著上調(diào)，IκBα蛋白明顯下調(diào)(P<0.01，圖3)。在提取的細(xì)胞核蛋白中，與SK-BR-3細(xì)胞相比，SK-BR-3/PTX細(xì)胞NF-κB p65蛋白顯著上調(diào)(P<0.01，圖3)。

圖3 SK-BR-3和SK-BR-3/PTX細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 miR-1246 inhibitor增強SK-BR-3/PTX細(xì)胞對PTX的敏感性 SK-BR-3/PTX細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC inhibitor和miR-1246 inhibitor后，miR-1246相對表達(dá)水平分別為(123.6%±9.6%)和(15.9%±2.1%)。與NC inhibitor組相比，miR-1246 inhibitor組相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，圖4A)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，NC inhibitor、NC inhibitor+PTX及miR-1246 inhibitor+PTX組的凋亡率分別為(5.1%±0.9%)、(16.6%±2.3%)、(41.1%±6.8%)。NC inhibitor+PTX組較NC inhibitor組細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.01)；相較于NC inhibitor+PTX組，miR-1246 inhibitor+PTX組細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01，圖4B)。

圖4 抑制miR-1246影響SK-BR-3/PTX細(xì)胞對PTX的敏感性

2.5 miR-1246 inhibitor抑制SK-BR-3/PTX細(xì)胞NF-κB通路活化和P-gp蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-1246 inhibitor組細(xì)胞總蛋白p-NF-κB p65和P-gp蛋白顯著下調(diào)，IκBα蛋白明顯上調(diào)(P<0.01，圖5)。在提取的細(xì)胞核蛋白中，與NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-1246 inhibitor組細(xì)胞NF-κB p65蛋白顯著下調(diào)(P<0.01，圖5)。

圖5 NC inhibitor和miR-1246 inhibitor組細(xì)胞各蛋白表達(dá)情況

3 討論

本研究成功構(gòu)建PTX耐藥乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3/PTX，耐藥指數(shù)為51.3。值得注意的是，miR-1246在SK-BR-3/PTX中表達(dá)上調(diào)。提示miR-1246可能在PTX耐藥中發(fā)揮一定作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，P-gp蛋白在SK-BR-3/PTX細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。P-gp屬于ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體超家族成員，通常在人體血腦屏障、腸腔膜、近曲小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞的藥物泵出胞外[11-12]。P-gp的底物主要是一些疏水親脂性藥物，如一些抗腫瘤藥、抗心律失常藥、激素類藥物、鈣拮抗藥等。研究顯示，P-gp誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物外流、微管蛋白突變、微管蛋白同型抗原的增加等均可引起紫杉醇耐藥[13]。本研究構(gòu)建的SK-BR-3/PTX細(xì)胞對PTX耐藥可能依賴于P-gp。

NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，因其能夠與B細(xì)胞免疫球蛋白的κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結(jié)合而得名[14]。研究已證實，NF-κB在乳腺癌細(xì)胞PTX耐藥中發(fā)揮作用[15]。因此，本研究對NF-κB信號通路進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p-NF-κB p65在SK-BR-3/PTX細(xì)胞總蛋白中上調(diào)，IκBα蛋白下調(diào)。而在核蛋白中，SK-BR-3/PTX細(xì)胞NF-κB p65蛋白上調(diào)。通常NF-κB p65與IκBα 蛋白結(jié)合并受到其抑制，IκBα表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致NF-κB p65磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核[16]。研究已證實，NF-κB為P-gp上游調(diào)節(jié)靶點，可介導(dǎo)后者的表達(dá)[17]。上述結(jié)果提示，SK-BR-3/PTX細(xì)胞PTX耐藥的維持可能與NF-κB通路活化，進(jìn)而上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)。但miR-1246是否在上述機制中發(fā)揮作用還有待于進(jìn)一步研究。

本研究采用轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-1246 inhibitor抑制SK-BR-3/PTX細(xì)胞miR-1246。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，miR-1246 inhibitor可顯著增強SK-BR-3/PTX細(xì)胞對PTX的敏感性。提示miR-1246參與介導(dǎo)SK-BR-3/PTX細(xì)胞對PTX的耐藥。分子水平上發(fā)現(xiàn)，miR-1246 inhibitor能抑制SK-BR-3/PTX細(xì)胞總蛋白中p-NF-κB p65和P-gp蛋白表達(dá)，并上調(diào)IκBα蛋白；同時，miR-1246 inhibitor還能抑制細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)水平。綜上，miR-1246可能通過激活NF-κB信號，從而促進(jìn)P-gp蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞對PTX耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥的新機制，可為臨床治療提供理論參考，但有關(guān)miR-1246的生物學(xué)作用還不夠完善，有待進(jìn)一步研究。