賀依靜,李橋,彭磊,李佳,初亞婕,林其昕,芮榮,劇世強(qiáng)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

真核細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中紡錘體牽引染色體準(zhǔn)確地分布到每個(gè)子細(xì)胞中,紡錘體的正確組裝與定位對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定、形態(tài)發(fā)生與維持起著重要作用[1]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2,TPX2)是一個(gè)紡錘體相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein,MAP),可以通過(guò)多種途徑參與紡錘體的定向與組裝[2-3]。TPX2作為Ran-GTP(guanosine triphosphate-bound form of Ras-related nuclear protein)通路的一個(gè)重要靶點(diǎn),Ran介導(dǎo)的TPX2在染色體附近被激活后,通過(guò)核定位序列(nuclear localization signal,NLS)被Ran-GTP的下游蛋白importin α識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后參與微管成核的調(diào)控[3-4]。對(duì)HeLa細(xì)胞的研究表明,TPX2經(jīng)Ran-GTP/importin α通路釋放到紡錘體,通過(guò)與AURKA激酶互作調(diào)控紡錘體極的穩(wěn)定性以及微管成核[5-8]。缺乏TPX2時(shí),動(dòng)粒和染色體臂無(wú)法捕獲足夠的中心體微管組裝為紡錘體,導(dǎo)致微管密度降低,紡錘體極不穩(wěn)定,出現(xiàn)多極紡錘體[9]。

TPX2在細(xì)胞周期調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用,在KEGG通路分析中被列為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,從S期開(kāi)始表達(dá)至有絲分裂結(jié)束[10-11]。對(duì)HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞的研究表明,敲低內(nèi)源性TPX2表達(dá)會(huì)使細(xì)胞阻滯在G2/M期[2,12]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TPX2可通過(guò)多種通路參與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡和增殖等過(guò)程的調(diào)控[13-14]。對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的體外研究表明,內(nèi)源性TPX2可以通過(guò)與AURKA互作調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[5];TPX2可以抑制前列腺癌細(xì)胞中CDK1表達(dá),進(jìn)一步抑制ERK/GSK3β/SNAIL信號(hào)通路,從而促進(jìn)前列腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11];與非惡性腫瘤相比,TPX2在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào),抑制TPX2表達(dá)可以下調(diào)Wnt通路抑制肝癌細(xì)胞增殖,引起肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[15];對(duì)乳腺癌細(xì)胞中的研究表明,沉默TPX2基因會(huì)抑制PI3k/AKT/P2Q1信號(hào)通路并激活p53信號(hào)加速細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖[14]。但目前關(guān)于TPX2在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂周期中的功能仍知之甚少。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞缺乏中心體結(jié)構(gòu),其紡錘體組裝方式與體細(xì)胞差異很大[16];卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中沒(méi)有S期,DNA復(fù)制一次后細(xì)胞連續(xù)分裂2次,周期進(jìn)程與體細(xì)胞有絲分裂也有較大差異[17]。那么,在卵母細(xì)胞成熟分裂過(guò)程中,TPX2是否也參與減數(shù)分裂過(guò)程中細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)分布及細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控目前尚不明確。本試驗(yàn)以體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞為研究模型,采用間接免疫熒光染色、蛋白免疫印跡、siRNA顯微注射和熒光定量PCR等方法研究TPX2在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中對(duì)紡錘體組裝以及細(xì)胞周期的調(diào)控作用,以期為更深入了解哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗TPX2抗體為美國(guó)Novus公司產(chǎn)品,兔抗α-Tubulin抗體、Hoechst 33342染料為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品,Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒為諾唯贊生物科技公司(南京)產(chǎn)品,Prime ScriptTMRT Master Mix為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品,SteadyPure通用型RNA提取試劑盒和SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒為艾科瑞生物公司(湖南)產(chǎn)品。其他試劑無(wú)特殊標(biāo)注者均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)與處理

豬卵巢均收集自南京本地屠宰場(chǎng),收集后立即放入裝有37 ℃無(wú)菌生理鹽水的保溫瓶中,2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,無(wú)菌處理后分離卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocytes complexe,COC)。挑選胞質(zhì)均勻、胞膜完整、包裹3層或3層以上卵丘細(xì)胞的COC,置于TCM-199培養(yǎng)液中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)[18-19]。體外培養(yǎng)44 h后,用0.1%透明質(zhì)酸酶消化去除卵丘細(xì)胞,收集卵母細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 顯微注射siRNA干擾TPX2表達(dá)

委托上海吉瑪基因公司(GenePharma)根據(jù)TPX2基因序列(XM_021078098.1)設(shè)計(jì)TPX2特異性干擾序列對(duì):5′-GCCCUUCGUUCCUAAGAUATT-3′/5′-UAUCUUAGGAACGAAGGGCTT-3′,使用無(wú)RNA酶水將siRNA稀釋至20 μmol·L-1后于-20 ℃凍存。將COC隨機(jī)分為對(duì)照組(Control group)、陰性對(duì)照(Negative control siRNA,NC-siRNA)組和TPX2-siRNA組,分別為無(wú)處理組以及注射無(wú)意義的siRNA和TPX2-siRNA。將生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV)的COC置于含2%胎牛血清的TCM199培養(yǎng)液中進(jìn)行顯微注射。平均每枚卵母細(xì)胞注射 20 pL siRNA,于體外成熟培養(yǎng)44 h,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 間接免疫熒光染色

將消化后的卵母細(xì)胞加入4%(體積分?jǐn)?shù))的多聚甲醛溶液中室溫固定1 h后移入含1% Triton X-100溶液中室溫通透過(guò)夜;經(jīng)磷酸鹽(PBS)緩沖液清洗3次(每次3 min)后,將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含10 g·L-1牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS中,37 ℃封閉1 h后用兔抗TPX2抗體(1∶1 000)4 ℃孵育8 h,PBS洗滌后用TRITC標(biāo)記的二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。使用鼠抗α-tubulin-FITC單克隆抗體(1∶200)37 ℃避光孵育2 h;使用Hoechest 33342進(jìn)行核染色后,置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM700 META,Oberkochen,德國(guó))下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)

每組收集80枚卵母細(xì)胞,放入聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)蛋白上樣緩沖液中煮沸10 min,之后通過(guò)PAGE分離樣品總蛋白。電泳結(jié)束后通過(guò)恒流半干轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。封閉液為含50 g·L-1脫脂奶粉的TBS,兔抗TPX2抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗分別按1∶1 000和1∶4 000使用封閉液稀釋。將PVDF膜置于封閉液中37 ℃孵育1 h,加入一抗稀釋液后于4 ℃孵育過(guò)夜,再加入二抗稀釋液并于 37 ℃孵育1 h,最后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物孵育30 s,用化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。

1.6 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,將洗滌好的卵母細(xì)胞置于含10% Annexin V-FITC的染色工作液中,室溫避光孵育30 min后轉(zhuǎn)移至4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中室溫固定30 min后封片,置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞凋亡率。

1.7 凋亡相關(guān)基因表達(dá)的熒光定量PCR(qPCR)測(cè)定

每組80枚卵母細(xì)胞,用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒提取RNA,再反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照SYBR?Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。使用2-ΔΔCT法計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物對(duì)序列Table 1 The primer pairs sequences used for real-time quantitative PCR

1.8 數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TPX2在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的亞細(xì)胞定位和動(dòng)態(tài)表達(dá)

使用對(duì)照組卵母細(xì)胞,分別在體外成熟培養(yǎng)0、20、28和44 h,收集生發(fā)泡期(GV)、生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD)、第一次減數(shù)分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)和第二次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ,MⅡ)卵母細(xì)胞[20]。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如圖1所示:在GV期和GVBD期,TPX2沒(méi)有明顯的熒光信號(hào),進(jìn)入MⅠ期后,TPX2開(kāi)始在紡錘體兩極富集,定位特點(diǎn)與α-tubulin相似。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,TPX2在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各階段均有不同程度的表達(dá);在GV期至GVBD期,TPX2蛋白表達(dá)量較低,GVBD期后TPX2蛋白表達(dá)量逐漸升高,MⅡ期表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)。

圖1 TPX2在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的亞細(xì)胞定位(A)與表達(dá)統(tǒng)計(jì)(B)Fig.1 The localization(A)and expression statistics(B)of TPX2 during the meiosis of porcine oocytes 1)GV:生發(fā)泡期Germinal vesicle;GVBD:生發(fā)泡破裂期Germinal vesicle breakdown;MⅠ:第一次減數(shù)分裂中期First metaphase of meiosis;ATⅠ:第一次減數(shù)分裂后末期First anaphase-telophase of meiosis;MⅡ:第二次減數(shù)分裂中期Second metaphase of meiosis. 紅色熒光表示TPX2 Red fluorescence shows TPX2;綠色熒光表示α-tubulin Green fluorescence shows α-tubulin;藍(lán)色熒光表示DNA Blue fluorescence shows nucleus. 2)圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Values with different superscripts indicate statistical significance at 0.05 level. 下同The same as follows.

2.2 注射siRNA對(duì)豬卵母細(xì)胞TPX2表達(dá)的影響

為探究TPX2在豬卵母細(xì)胞細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中潛在的作用,向GV期卵母細(xì)胞注射TPX2特異性siRNA以干擾內(nèi)源性TPX2的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示:與對(duì)照組相比,體外成熟培養(yǎng)44 h后TPX2-siRNA組TPX2蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。提示注射TPX2特異性siRNA有效敲低了TPX2表達(dá)。

圖2 顯微注射TPX2特異性siRNA 敲低TPX2表達(dá)Fig.2 TPX2 knockdown by microinjecting of TPX2-siRNA

2.3 敲低TPX2對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響

卵母細(xì)胞第一極體(first polar body,PB1)的排出是卵母細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志。在GV期注射TPX2特異性siRNA后體外培養(yǎng)44 h,在體視顯微鏡下觀察PB1的排出情況。結(jié)果如圖3-A所示:與對(duì)照組相比TPX2-siRNA組PB1排出率顯著下降(P<0.05),卵母細(xì)胞成熟受到抑制。為進(jìn)一步探究敲低TPX2后卵母細(xì)胞成熟失敗的原因,試驗(yàn)利用免疫熒光染色對(duì)體外培養(yǎng)44 h后的卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期進(jìn)程分析,通過(guò)紡錘體結(jié)構(gòu)以及染色體特征對(duì)細(xì)胞所處時(shí)期進(jìn)行劃分。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3-B所示:TPX2-siRNA組的細(xì)胞大多阻滯在GVBD期(36.53%)和第一次減數(shù)分裂后末期(anaphaseⅠand telophaseⅠ,ATⅠ)(28.10%),而發(fā)育到MⅡ期的卵母細(xì)胞比例僅為 23.39%,對(duì)照組卵母細(xì)胞大部分(67.56%,P<0.05)發(fā)育至MⅡ期。

2.4 敲低TPX2對(duì)紡錘體結(jié)構(gòu)的影響

為探究敲低TPX2導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程阻滯的原因,檢測(cè)了敲低TPX2表達(dá)后卵母細(xì)胞紡錘體的組裝情況。結(jié)果如圖4所示:對(duì)照組大多數(shù)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)44 h后形成雙極紡錘體結(jié)構(gòu)并排出第一極體,而與對(duì)照組相比TPX2-siRNA組卵母細(xì)胞紡錘體異常率顯著升高(P<0.05),主要表現(xiàn)為多極紡錘體或紡錘體崩解等異常情況,并伴隨有染色體分離的異常。

2.5 敲低TPX2表達(dá)誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞發(fā)生早期凋亡

本試驗(yàn)通過(guò)Annexin V-FITC染色對(duì)豬卵母細(xì)胞進(jìn)行早期凋亡鑒定。結(jié)果如圖5所示:與對(duì)照組相比,TPX2-siRNA組中卵母細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯綠色熒光信號(hào),提示發(fā)生了早期凋亡[21]。統(tǒng)計(jì)分析顯示,TPX2-siRNA組凋亡卵母細(xì)胞比例(60.48%)顯著高于對(duì)照組(19.48%,P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl2和凋亡基因Caspase3 mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,TPX2-siRNA組Bax/Bcl2值顯著上升(P<0.05),Caspase3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果提示敲低TPX2表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 敲低TPX2對(duì)減數(shù)分裂進(jìn)程的影響Fig.3 Effects of TPX2 knockdown on the process of meiosis A.體外培養(yǎng)44 h后細(xì)胞形態(tài)和第一極體Representative images of first polar body(PB1)extrusion(Arrow:the PB1)after 44 h of culture;B. 第一極體排出率The PB1 extrusion rate;C. 豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期紡錘體形態(tài)和染色體排列的代表性圖像Representative images of spindle morphology and chromosome alignment in porcine oocytes during meiotic progression;D. 敲低TPX2表達(dá)后細(xì)胞周期進(jìn)程(44 h)TPX2-siRNA interference disrupted the cell cycle progression in porcine oocytes(44 h).

圖4 敲低TPX2對(duì)紡錘體組裝的影響Fig.4 Effects of TPX2-knockdown on the assembly of spindle A. 卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體排列的代表性圖像Representative images of spindle morphology and chromosomes alignment(藍(lán)色Blue:染色體Chromosome;綠色Green:α-tubulin);B. 紡錘體異常卵母細(xì)胞的百分比 Percentage of spindle defects in oocytes.

圖5 敲低TPX2表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of TPX2-knockdown on apoptosis relative gene expression of oocytes A. 卵母細(xì)胞Annexin V-FITC熒光信號(hào)的圖像 Representative images of Annexin V-FITC staining in oocytes;B. 卵母細(xì)胞凋亡率Apoptosis rate of oocytes;C. 相關(guān)基因表達(dá)水平Relative gene expression level.

3 討論

TPX2蛋白在紡錘體組裝、細(xì)胞周期調(diào)控等方面的功能一直是細(xì)胞有絲分裂調(diào)控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),但其在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的功能研究尚不多見(jiàn)。本研究以體外成熟過(guò)程中的豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象,結(jié)合顯微注射、蛋白免疫印跡等方法,探討了TPX2在豬卵母細(xì)胞體外成熟分裂過(guò)程中作用的潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白的亞細(xì)胞定位與紡錘體動(dòng)態(tài)分布密切相關(guān),干擾TPX2表達(dá)后導(dǎo)致紡錘體結(jié)構(gòu)異常,并誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡,最終導(dǎo)致其成熟失敗。

在豬卵母細(xì)胞MⅠ期和MⅡ期,TPX2與微管蛋白α-tubulin呈現(xiàn)共定位趨勢(shì),并主要富集在紡錘體兩極。這與在HeLa細(xì)胞上的研究結(jié)果類似,在有絲分裂過(guò)程中TPX2最先出現(xiàn)在微管的星狀體處,之后逐漸分布在整個(gè)紡錘體[22]。這種定位模式提示TPX2參與豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的紡錘體組裝,與紡錘體穩(wěn)定性密切相關(guān)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,在微管蛋白形成早期TPX2的表達(dá)量較低,MⅠ期開(kāi)始逐漸升高且持續(xù)表達(dá)至MⅡ期。Kim等[23]在豬卵母細(xì)胞中的研究表明,無(wú)中心體微管組織中心(acentriolar microtubule organization center,aMTOC)的相關(guān)成分,如Cep192和PCNT在GVBD期之前均無(wú)表達(dá),其模式與本試驗(yàn)中TPX2的表達(dá)模式相似,據(jù)此文章推測(cè)TPX2作為一種紡錘體相關(guān)蛋白(MAP),在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中可能與aMTOC的形成有關(guān)。

顯微注射特異性siRNA抑制TPX2表達(dá)之后,第一極體排出率顯著下降,卵母細(xì)胞成熟分裂進(jìn)程發(fā)生阻滯。統(tǒng)計(jì)顯示,試驗(yàn)組多數(shù)細(xì)胞阻滯在了GVBD期和ATⅠ期,TPX2-siRNA組大部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)紡錘體形態(tài)異?；蚣忓N體不穩(wěn)定,無(wú)法正確牽引染色體向紡錘體兩極移動(dòng)。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂要連續(xù)經(jīng)歷2次不對(duì)稱分裂,這個(gè)過(guò)程中涉及細(xì)胞骨架以及細(xì)胞周期的精密協(xié)調(diào)[24]。體外培養(yǎng)44 h后,TPX2-siRNA組出現(xiàn)了微管蛋白α-tubulin密度降低,染色體排列不規(guī)則,紡錘體崩解等異?，F(xiàn)象,與有絲分裂中的研究結(jié)果一致[25],提示TPX2在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中與紡錘體組裝及染色體的分離密切相關(guān)。

體細(xì)胞分裂調(diào)控相關(guān)研究表明,抑制TPX2表達(dá)可下調(diào)Caspase 3通路,誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-15,26]。本研究發(fā)現(xiàn),siRNA干擾TPX2表達(dá)后豬卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著高于對(duì)照組,Bax/Bcl2值和Caspase3基因表達(dá)量顯著上升。這些結(jié)果驗(yàn)證了TPX2在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中也會(huì)參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,敲低TPX2的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,與部分癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[15,26]。敲低TPX2引起的細(xì)胞凋亡可能是卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯,體外成熟失敗的一個(gè)重要原因。

綜上,本研究結(jié)果表明TPX2在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中的表達(dá)具有明顯的階段性特點(diǎn),其亞細(xì)胞定位與微管蛋白α-tubulin的動(dòng)態(tài)分布緊密相關(guān)。特異性siRNA干擾試驗(yàn)揭示TPX2對(duì)豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體的組裝及細(xì)胞周期的調(diào)控具有重要的調(diào)節(jié)作用。敲低TPX2表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟失敗。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體組裝、染色體分離等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)控機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù),也為提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量提供了理論參考。