李會(huì)杰 董蓮華 陳桂芳 劉思淵 楊佳怡 楊靖亞

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心，北京 100029；3.沈陽(yáng)化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110142）

椰毒假單胞菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，多生長(zhǎng)在谷類發(fā)酵制品、薯類制品、變質(zhì)銀耳等食品表面［1-2］。該菌在一定條件下產(chǎn)生米酵菌酸和毒黃素兩種脂肪酸類小分子物質(zhì)，具有毒性作用［3-4］。其中，米酵菌酸毒性較強(qiáng)，它結(jié)合線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)二磷酸腺苷/三磷酸腺苷（ADP/ATP）載體，影響ATP 代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5-6］。流行病學(xué)分析表明，椰毒假單胞菌食物中毒具有地域性特點(diǎn)，且具有明顯的季節(jié)性，主要發(fā)生在中國(guó)、東南亞以及非洲地區(qū)，多發(fā)于夏秋季［2，7］。2010年到至今，在我國(guó)廣西、云南、浙江、貴州、廣東、黑龍江等地陸續(xù)報(bào)道了多起椰毒假單胞菌食物中毒事件，造成中毒者嚴(yán)重的身體機(jī)能損害甚至死亡［8-10］。

目前，椰毒假單胞菌食物中毒的解毒藥物尚未發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌及其外毒素的檢測(cè)可從源頭監(jiān)測(cè)污染狀況，避免中毒事件的發(fā)生。根據(jù)GB 5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》，經(jīng)過(guò)樣品提取、過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色譜法分析［11］。該方法操作繁瑣，檢測(cè)結(jié)果易受基質(zhì)干擾，無(wú)法滿足復(fù)雜基質(zhì)食品中米酵菌酸的快速定量分析要求。氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)分析也被用于食品中米酵菌酸的檢測(cè)，但儀器要求較高，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)有一定的限制，對(duì)較低濃度米酵菌酸，存在漏檢的可能［12-13］。針對(duì)食品中椰毒假單胞菌的檢測(cè)是更為直接的方法，具有重要意義。根據(jù)GB 4789.29-2020《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）的檢驗(yàn)》［14］，通過(guò)增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基分離、生化鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等過(guò)程進(jìn)行檢驗(yàn)，該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測(cè)，不利于中毒者的及時(shí)診治。核酸體外擴(kuò)增的檢測(cè)方法具有迅速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。馬曉燕等［15］建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用特異性引物在恒溫條件下對(duì)椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列進(jìn)行快速擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)觀察條帶驗(yàn)證是否存在細(xì)菌污染，該方法只能實(shí)現(xiàn)定性。林捷等［16］針對(duì)16S-23S rRNA 序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)（quantitative real-time PCR，qPCR），該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性直接影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）因特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)在食源性致病菌的定量檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，提高了食源性致病菌的檢測(cè)效率［17-18］，如大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌等［19-20］。ddPCR 使DNA 分子隨機(jī)、獨(dú)立地分布在每個(gè)反應(yīng)單元，對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行PCR 反應(yīng)后對(duì)熒光信號(hào)計(jì)數(shù)，結(jié)合泊松分布得到DNA 分子拷貝數(shù)，無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的絕對(duì)定量檢測(cè)。魏詠新等［21］針對(duì)大腸埃希氏菌O157∶H7 單拷貝基因hlyA 建立ddPCR 方法，對(duì)人工污染的三文魚(yú)樣品進(jìn)行特異性定量檢測(cè)，檢出限為110 CFU/g。在食品基質(zhì)中對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的要求是零檢出［22］，Wang 等［23］針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌FimY基因建立ddPCR 方法，快速定量檢測(cè)人工污染牛奶樣品，檢出限為250 CFU/mL。在上述研究中，研究者通過(guò)比較ddPCR 和qPCR 方法的定量檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ddPCR 檢出限更低。針對(duì)椰毒假單胞菌污染發(fā)酵米面等食物導(dǎo)致嚴(yán)重的食物中毒，且目前沒(méi)有準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法的現(xiàn)狀，本研究根據(jù)16S-23S rRNA 序列，建立了椰毒假單胞菌ddPCR定量檢測(cè)方法，ddPCR 對(duì)人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL 與平板計(jì)數(shù)法相比，ddPCR 方法縮短了檢測(cè)周期，有利于食品中椰毒假單胞菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（貨號(hào)：A1120，天根生化科技有限公司）；上下游引物、探針（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；密封墊（Gaskets for QX200/QX100）、微滴發(fā)生卡（Cartridges for QX200/QX100）、ddPCR 預(yù)混液、微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油（美國(guó)Bio-Rad 公司）；實(shí)驗(yàn)所用菌株詳見(jiàn)表1，其中椰毒假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC10574）和黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC2219）均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC），其它標(biāo)準(zhǔn)菌株為實(shí)驗(yàn)室保存。所有菌株均在各自的指示培養(yǎng)基上活化后備用。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌種Table 1 Strains for experiment

1.1.2 儀器與設(shè)備 Veriti PCR 儀（美國(guó) Applied BioSystems 公司）；微滴分析儀、微滴生成儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Nanodrop2000 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）；LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀（德國(guó)Roche 公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 為實(shí)現(xiàn)對(duì)椰毒假單胞菌的特異性檢測(cè)和絕對(duì)定量分析，選取該菌中具有高度種屬特異性且高度保守的16S-23S rRNA 序列（基因號(hào) EF552059）作為靶序列，利用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和探針，并通過(guò)NCBI 在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，引物和探針序列見(jiàn)表2。探針5'端以熒光基團(tuán)FAM 標(biāo)記，3'端以淬滅基團(tuán)BHQ 標(biāo)記。

表2 ddPCR 引物和探針序列Table 2 Primers’ and probes’ sequences of ddPCR

1.2.2 基因組DNA 提取 將椰毒假單胞菌（CICC10574）接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min 搖床過(guò)夜培養(yǎng)。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer Saline，PBS）對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，至108稀釋度。取各稀釋度菌液1 mL，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根，貨號(hào)：A1120）分別提取基因組DNA。操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書，最后，用50 μL TE 緩沖液洗脫提取的基因組DNA。

1.2.3 平板計(jì)數(shù) 取1.2.2 中10 倍梯度稀釋的椰毒假單胞菌純培養(yǎng)菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，取100 μL 各稀釋度菌液加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）內(nèi)，用涂布棒均勻涂開(kāi)后，37℃倒置培養(yǎng)24±2 h，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行。保證菌落數(shù)在（20-300）CFU 范圍內(nèi)、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)結(jié)果取3 個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。

1.2.4 ddPCR 檢測(cè)方法 對(duì)ddPCR 反應(yīng)體系中退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜的PCR 擴(kuò)增程序。以椰毒假單胞菌基因組DNA 為模板，設(shè)置退火溫度在54℃、56℃、58℃、60℃和62℃ 下進(jìn)行ddPCR 擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后，將96 孔板放置到微滴檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，篩選陽(yáng)性微滴簇和陰性微滴簇分離明顯的溫度為ddPCR 檢測(cè)方法的退火溫度。

采用優(yōu)化后的退火溫度，對(duì)引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定合適的引物和探針濃度。選取引物工作濃度為0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L，探針工作濃度為0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)ddPCR 檢測(cè)結(jié)果選取合適的引物和探針濃度。

ddPCR 反應(yīng)采用20 μL 體系，包括ddPCR 預(yù)混液（10 μL），上、下游引物（2.4 μL，工作濃度為0.6 μmol/L），探針（0.6 μL，工作濃度為0.3 μmol/L），DNA 模板（5 μL），去離子水補(bǔ)足20 μL。將20 μL反應(yīng)體系和60 μL 微滴生成油分別加入到微滴發(fā)生卡對(duì)應(yīng)的孔中，通過(guò)微滴生成儀生成油包水的微滴。將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96 孔板后封膜，將封好的96孔板置于PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 10 min；變性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；熱失活98℃ 10min。擴(kuò)增完成后，將96 孔板置于微滴讀取儀進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步讀取結(jié)果并分析。ddPCR 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的菌懸液濃度的換算公式如下：

上式中：C為對(duì)應(yīng)的菌懸液濃度（CFU/mL）；c1為核酸拷貝數(shù)濃度（copies/μL）；n為反應(yīng)體系中DNA 模板稀釋倍數(shù)；v1為提取核酸的最終洗脫體積（μL）；v2為提取的菌懸液體積（mL）。

1.2.5 ddPCR 檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證 由于在椰毒假單胞菌中毒事件源頭查找過(guò)程中，易與黃曲霉、枯草芽孢桿菌等常見(jiàn)食源性致病菌混淆，黑龍江“酸湯子”食物中毒事件就曾被誤認(rèn)為是“黃曲霉毒素中毒”［24］。為驗(yàn)證所建立的ddPCR 檢測(cè)方法的特異性，將提取的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照，選取黃曲霉、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌等7 種食源性致病菌（表1）提取的基因組DNA 作為模板，采用1.2.1 節(jié)中設(shè)計(jì)的引物和探針，按照1.2.4 節(jié)中的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 qPCR 檢測(cè)方法 qPCR 反應(yīng)體系包括：qPCR預(yù)混液（12.5 μL），上、下游引物（1.5 μL，工作濃度為0.6 μmol/L），探針（0.75 μL，工作濃度為0.3 μmol/L），待測(cè)DNA 模板（5 μL），去離子水補(bǔ)足25 μL。置于LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃ 10 min；變性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。取已知拷貝數(shù)濃度的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程和Ct 值計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)濃度。

1.2.7 人工污染糯米湯樣品的檢測(cè) 糯米湯易被椰毒假單胞菌污染，導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生，選擇糯米湯作為食品基質(zhì)。對(duì)椰毒假單胞菌原菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同時(shí)取104、105、106、107稀釋度菌液各5 mL 分別添加到5 mL 糯米湯中，每個(gè)稀釋度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，制成含有不同椰毒假單胞菌添加水平的污染樣品。另取5 mL PBS 加入5 mL 糯米湯中作為陰性對(duì)照。對(duì)不同添加水平的人工污染樣品分別梯度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。用細(xì)菌基因組試劑盒（天根，貨號(hào)：A1120）對(duì)不同添加水平的椰毒假單胞菌污染糯米湯樣品進(jìn)行提取，同時(shí)進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測(cè)。

1.2.8 人工污染糯米湯樣品中ddPCR 檢測(cè)方法特異性的驗(yàn)證 在核酸水平特異性驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，為驗(yàn)證實(shí)際樣品中所建立ddPCR 檢測(cè)方法的特異性，采用椰毒假單胞菌與金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時(shí)污染糯米湯樣品，在4 mL糯米湯樣品中，加入椰毒假單胞菌的濃度梯度為（3×102-3×105）CFU/mL，其他7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。混合均勻后用細(xì)菌基因組試劑盒（天根，貨號(hào)：A1120）進(jìn)行提取，并進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ddPCR檢測(cè)方法體系優(yōu)化結(jié)果

為優(yōu)化ddPCR 檢測(cè)方法的退火溫度，將退火溫度分別設(shè)置為54℃、56℃、58℃、60℃和62℃進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1-A 所示，當(dāng)退火溫度為56℃時(shí)，陽(yáng)性微滴簇與陰性微滴簇區(qū)分明顯，且各微滴簇較為集中，選擇56℃為椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)的退火溫度。優(yōu)化引物和探針的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-B，引物和探針的工作濃度分別為0.6 μmol/L 與0.3 μmol/L 時(shí)，陽(yáng)性微滴簇和陰性微滴簇區(qū)分最為明顯，且微滴簇之間彌散微滴較少，確定該濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的工作濃度。

圖1 ddPCR 方法的退火溫度（A）、引物和探針濃度（B）優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature（A），concentration of primer and probe（B）of ddPCR

2.2 ddPCR檢測(cè)方法具有良好的特異性

由于黃曲霉與椰毒假單胞菌均易污染發(fā)酵玉米面等食品，在檢測(cè)過(guò)程中可能發(fā)生混淆，因此選取黃曲霉作為對(duì)照菌株。此外，還選取了金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌等6 種常見(jiàn)的食源性致病菌（表1），驗(yàn)證所建立的ddPCR 檢測(cè)方法的特異性。以表1中菌株的基因組DNA 作為模板進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，只有椰毒假單胞菌基因組DNA 被檢測(cè)出陽(yáng)性微滴信號(hào)，而其它7 種菌株基因組DNA 檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，表明設(shè)計(jì)的引物和探針具有良好的特異性?？杀苊馐澄镏卸臼录凡椴≡倪^(guò)程中多種致病菌的干擾，有利于椰毒假單胞菌的準(zhǔn)確檢出。

圖2 椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)方法的特異性結(jié)果Fig.2 Specificity of ddPCR for Pseudomonas cocovenenans

2.3 椰毒假單胞菌菌液ddPCR與qPCR、平板計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果的比較

ddPCR 在102稀釋度時(shí)，陽(yáng)性微滴的比率為100%，不滿足泊松分布，超出ddPCR 的定量范圍。菌液在（1.53×103-4.13×105）CFU/mL 濃度范圍內(nèi)，ddPCR 檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）均小于6%，說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性。針對(duì)3.25×102CFU/mL（107稀釋度）菌液進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，RSD 值為16.29%，此時(shí)ddPCR檢測(cè)讀數(shù)結(jié)果為1.38 copies/μL，若濃度更低則無(wú)法檢出。ddPCR 方法的檢出限為3.25×102CFU/mL（表3）。

如表4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值計(jì)算出的各稀釋度菌液濃度。在（5.42×103-2.75×108）CFU/mL 范圍內(nèi)，qPCR 檢測(cè)結(jié)果的RSD 值均小于6%，說(shuō)明該方法重復(fù)性好。qPCR 在106稀釋度時(shí)已超出其檢測(cè)范圍（Ct ≥ 35），檢出限為5.42×103CFU/mL。相比于ddPCR 方法，qPCR 方法的檢出限更高，然而該方法可檢測(cè)到2.75×108CFU/mL 的高濃度菌液，具有更廣泛的檢測(cè)范圍。

為比較3 種檢測(cè)方法的檢出限和靈敏度，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法，椰毒假單胞菌原菌液濃度為1.02×109CFU/mL；qPCR 方法在有效檢測(cè)范圍內(nèi)，由各稀釋度計(jì)算出的原菌液濃度的平均值為1.1×109CFU/mL；ddPCR 方法計(jì)算出的原菌液濃度為1.2×109CFU/mL。ddPCR 檢測(cè)結(jié)果比平板計(jì)數(shù)結(jié)果高18%，這可能是由于部分細(xì)菌處于存活非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturabe，VBNC），該狀態(tài)通過(guò)平板培養(yǎng)方法無(wú)法形成菌落，核酸檢測(cè)可檢出VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌，導(dǎo)致平板計(jì)數(shù)結(jié)果偏低［25-27］。如圖3所示，線段的起止代表不同方法的檢測(cè)范圍，當(dāng)菌液稀釋度低于103（濃度高于4.13×105CFU/mL）時(shí)，超出ddPCR 方法的定量范圍，仍可通過(guò)qPCR 方法進(jìn)行定量檢測(cè)。ddPCR 方法的檢出限（3.25×102CFU/mL）低于qPCR 方法（5.42×103CFU/mL）。兩種方法在其檢測(cè)范圍內(nèi)均具有較好的重復(fù)性，ddPCR 方法具有更高的靈敏度，qPCR 方法對(duì)于高濃度的菌液，具有更廣泛的檢測(cè)范圍。

圖3 三種檢測(cè)方法對(duì)不同濃度椰毒假單胞菌檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Different concentration results of P.cocovenenans by 3 detection methods

2.4 人工污染糯米湯樣品的檢測(cè)結(jié)果

取104-107稀釋度椰毒假單胞菌菌液添加到糯米湯中，根據(jù)添加菌液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果，人工污染糯米湯樣品中椰毒假單胞菌的添加量為（3.4×102-3.4×105）CFU/mL。對(duì)不同添加量的人工污染糯米湯樣品同時(shí)進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測(cè)以及平板計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖4所示。ddPCR 對(duì)107稀釋度菌液添加水平仍能檢出，qPCR 不能檢出，ddPCR 具有更高的靈敏度，對(duì)人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL。在各添加水平菌液污染糯米湯樣品的檢測(cè)結(jié)果中，ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的RSD 值均小于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD 值，具有更好的重復(fù)性。此外，從細(xì)菌基因組提取到ddPCR 檢測(cè)可在4 h 內(nèi)完成，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)時(shí)間需包含細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的時(shí)間，需要至少18 h。與平板計(jì)數(shù)法相比，ddPCR 檢測(cè)方法明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，有利于食物中毒的快速檢測(cè)分析，從而提高相關(guān)診斷治療的科學(xué)性。

圖4 人工污染樣品中椰毒假單胞菌的定量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Quantitative results of Pseudomonas cocovenenans in artificially contaminated samples

2.5 人工污染糯米湯樣品中ddPCR 檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證結(jié)果

2.2 的結(jié)果表明建立的ddPCR 檢測(cè)方法在核酸水平具有較好的特異性。制備椰毒假單胞菌和金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時(shí)污染的糯米湯樣品，對(duì)該方法在實(shí)際樣品中檢測(cè)的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。在人工污染糯米湯樣品中加入的椰毒假單胞菌濃度為（3×102-3×105）CFU/mL，金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。對(duì)單一（椰毒假單胞菌）和多種食源性致病菌污染的糯米湯樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)并比較其定量結(jié)果。結(jié)果如圖5所示，在椰毒假單胞菌不同水平的污染糯米湯樣品中，添加較高濃度的金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌，對(duì)于椰毒假單胞菌的定量結(jié)果沒(méi)有影響。表明建立的ddPCR 檢測(cè)方法在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中具有較強(qiáng)的抗干擾能力，表現(xiàn)出較好的特異性。

圖5 人工污染樣品中椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Specificity verification of ddPCR method for the detection of P.cocovenenans in artificially contaminated samples

3 討論

2020年10月黑龍江省雞西市發(fā)生“酸湯子”食物中毒事件，9 名食用者全部死亡。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查與采樣檢測(cè)，在患者胃液及其食用的玉米面中檢出細(xì)菌毒素米酵菌酸，證實(shí)此次食物中毒事件是由椰毒假單胞菌污染產(chǎn)生的米酵菌酸所致［28］。椰毒假單胞菌引起食物中毒的潛伏期是4 h-6 h，初始中毒癥狀包括腹痛、全身無(wú)力、大量出汗、疲倦和嗜睡以及昏迷，在初始癥狀發(fā)作后 2 h-24 h 內(nèi)導(dǎo)致死亡［29］。椰毒假單胞菌污染食品的可能途徑很多，如原材料污染、工廠生產(chǎn)過(guò)程污染等［30-31］。同時(shí)，該菌溫度適應(yīng)范圍廣，在26℃-37℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，低溫下也可存活，食物儲(chǔ)存方式不當(dāng)可能導(dǎo)致椰毒假單胞菌污染，其產(chǎn)生米酵菌酸毒素，對(duì)肝臟和腎臟等器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，目前仍缺乏特效解毒藥物［3，32］。本研究針對(duì)椰毒假單胞菌高度保守的16S-23S rRNA 序列，優(yōu)化并建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的定量檢測(cè)方法?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.29-2020 采用平板培養(yǎng)結(jié)合毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)椰毒假單胞菌進(jìn)行檢測(cè)［33］，樣品經(jīng)GVC 選擇性增菌液分離椰毒假單胞菌，該增菌液添加了龍膽紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及氯霉素抑制其他多種革蘭氏陰性菌，再利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)。平板培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于食物中毒事件中快速確定致病菌并進(jìn)行治療。已有研究表明：細(xì)菌在低溫、紫外線等脅迫條件下可能進(jìn)入存活非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)，VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌仍具有代謝活性，但通過(guò)平板培養(yǎng)不能形成菌落［24，34］，因此可能導(dǎo)致平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果偏低。與平板計(jì)數(shù)法相比，數(shù)字PCR 方法可避免檢測(cè)過(guò)程中細(xì)菌VBNC 狀態(tài)的影響。該方法將檢測(cè)時(shí)間由18 h 以上縮短至4 h 以內(nèi)，其檢測(cè)結(jié)果的RSD 小于平板計(jì)數(shù)法，顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

基于PCR 擴(kuò)增技術(shù)，已有研究人員建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、熒光定量PCR 法并用于椰毒假單胞菌的檢測(cè)，但是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法只能實(shí)現(xiàn)定性分析，熒光定量PCR 法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)［15-16］。目前尚無(wú)針對(duì)椰毒假單胞菌的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，本研究采用的數(shù)字PCR 方法不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。該方法通過(guò)將DNA 分子無(wú)限稀釋，使每個(gè)反應(yīng)單元中包含至少一個(gè)拷貝的核酸分子，經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增，通過(guò)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)的單元數(shù)結(jié)合泊松分布的原理計(jì)算目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量檢測(cè)。本研究利用數(shù)字PCR 技術(shù)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了針對(duì)椰毒假單胞菌核酸的絕對(duì)定量方法。在與其他常見(jiàn)食源性致病菌共同污染樣品的檢測(cè)過(guò)程中，該方法表現(xiàn)出良好的特異性。針對(duì)含不同菌液濃度的人工污染糯米湯樣品，該方法的檢出限為361 CFU/mL，而對(duì)于該濃度的人工污染樣品，qPCR 方法不能檢出，因此數(shù)字PCR 方法具有更高的靈敏度。本研究建立的數(shù)字PCR 方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)快速等特點(diǎn)，能夠?yàn)橐炯賳伟目焖贉?zhǔn)確檢測(cè)提供參考，有助于預(yù)防中毒事件的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究依據(jù)椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列，通過(guò)優(yōu)化ddPCR 反應(yīng)條件，建立了基于ddPCR 技術(shù)的定量檢測(cè)方法。該方法具有較好的特異性與準(zhǔn)確性，有利于潛在污染樣品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測(cè)，未來(lái)可在食品安全監(jiān)測(cè)與中毒分析等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。