李會(huì)杰 董蓮華 陳桂芳 劉思淵 楊佳怡 楊靖亞
(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心,北京 100029;3.沈陽(yáng)化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,沈陽(yáng) 110142)
椰毒假單胞菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧菌,多生長(zhǎng)在谷類發(fā)酵制品、薯類制品、變質(zhì)銀耳等食品表面[1-2]。該菌在一定條件下產(chǎn)生米酵菌酸和毒黃素兩種脂肪酸類小分子物質(zhì),具有毒性作用[3-4]。其中,米酵菌酸毒性較強(qiáng),它結(jié)合線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)載體,影響ATP 代謝途徑,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。流行病學(xué)分析表明,椰毒假單胞菌食物中毒具有地域性特點(diǎn),且具有明顯的季節(jié)性,主要發(fā)生在中國(guó)、東南亞以及非洲地區(qū),多發(fā)于夏秋季[2,7]。2010年到至今,在我國(guó)廣西、云南、浙江、貴州、廣東、黑龍江等地陸續(xù)報(bào)道了多起椰毒假單胞菌食物中毒事件,造成中毒者嚴(yán)重的身體機(jī)能損害甚至死亡[8-10]。
目前,椰毒假單胞菌食物中毒的解毒藥物尚未發(fā)現(xiàn),細(xì)菌及其外毒素的檢測(cè)可從源頭監(jiān)測(cè)污染狀況,避免中毒事件的發(fā)生。根據(jù)GB 5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》,經(jīng)過(guò)樣品提取、過(guò)濾后,進(jìn)行高效液相色譜法分析[11]。該方法操作繁瑣,檢測(cè)結(jié)果易受基質(zhì)干擾,無(wú)法滿足復(fù)雜基質(zhì)食品中米酵菌酸的快速定量分析要求。氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)分析也被用于食品中米酵菌酸的檢測(cè),但儀器要求較高,對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)有一定的限制,對(duì)較低濃度米酵菌酸,存在漏檢的可能[12-13]。針對(duì)食品中椰毒假單胞菌的檢測(cè)是更為直接的方法,具有重要意義。根據(jù)GB 4789.29-2020《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的檢驗(yàn)》[14],通過(guò)增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基分離、生化鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等過(guò)程進(jìn)行檢驗(yàn),該方法檢測(cè)周期長(zhǎng),無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測(cè),不利于中毒者的及時(shí)診治。核酸體外擴(kuò)增的檢測(cè)方法具有迅速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。馬曉燕等[15]建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),利用特異性引物在恒溫條件下對(duì)椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列進(jìn)行快速擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),通過(guò)觀察條帶驗(yàn)證是否存在細(xì)菌污染,該方法只能實(shí)現(xiàn)定性。林捷等[16]針對(duì)16S-23S rRNA 序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)(quantitative real-time PCR,qPCR),該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量,標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性直接影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
微滴式數(shù)字PCR(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)因特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)在食源性致病菌的定量檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛,提高了食源性致病菌的檢測(cè)效率[17-18],如大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌等[19-20]。ddPCR 使DNA 分子隨機(jī)、獨(dú)立地分布在每個(gè)反應(yīng)單元,對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行PCR 反應(yīng)后對(duì)熒光信號(hào)計(jì)數(shù),結(jié)合泊松分布得到DNA 分子拷貝數(shù),無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的絕對(duì)定量檢測(cè)。魏詠新等[21]針對(duì)大腸埃希氏菌O157∶H7 單拷貝基因hlyA 建立ddPCR 方法,對(duì)人工污染的三文魚(yú)樣品進(jìn)行特異性定量檢測(cè),檢出限為110 CFU/g。在食品基質(zhì)中對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的要求是零檢出[22],Wang 等[23]針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌FimY基因建立ddPCR 方法,快速定量檢測(cè)人工污染牛奶樣品,檢出限為250 CFU/mL。在上述研究中,研究者通過(guò)比較ddPCR 和qPCR 方法的定量檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)ddPCR 檢出限更低。針對(duì)椰毒假單胞菌污染發(fā)酵米面等食物導(dǎo)致嚴(yán)重的食物中毒,且目前沒(méi)有準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法的現(xiàn)狀,本研究根據(jù)16S-23S rRNA 序列,建立了椰毒假單胞菌ddPCR定量檢測(cè)方法,ddPCR 對(duì)人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL 與平板計(jì)數(shù)法相比,ddPCR 方法縮短了檢測(cè)周期,有利于食品中椰毒假單胞菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
1.1.1 材料與試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(貨號(hào):A1120,天根生化科技有限公司);上下游引物、探針(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司);培養(yǎng)基(北京路橋技術(shù)股份有限公司);密封墊(Gaskets for QX200/QX100)、微滴發(fā)生卡(Cartridges for QX200/QX100)、ddPCR 預(yù)混液、微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油(美國(guó)Bio-Rad 公司);實(shí)驗(yàn)所用菌株詳見(jiàn)表1,其中椰毒假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC10574)和黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC2219)均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),其它標(biāo)準(zhǔn)菌株為實(shí)驗(yàn)室保存。所有菌株均在各自的指示培養(yǎng)基上活化后備用。
表1 實(shí)驗(yàn)用菌種Table 1 Strains for experiment
1.1.2 儀器與設(shè)備 Veriti PCR 儀(美國(guó) Applied BioSystems 公司);微滴分析儀、微滴生成儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);Nanodrop2000 超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo 公司);LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀(德國(guó)Roche 公司)。
1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 為實(shí)現(xiàn)對(duì)椰毒假單胞菌的特異性檢測(cè)和絕對(duì)定量分析,選取該菌中具有高度種屬特異性且高度保守的16S-23S rRNA 序列(基因號(hào) EF552059)作為靶序列,利用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和探針,并通過(guò)NCBI 在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì),引物和探針序列見(jiàn)表2。探針5'端以熒光基團(tuán)FAM 標(biāo)記,3'端以淬滅基團(tuán)BHQ 標(biāo)記。
表2 ddPCR 引物和探針序列Table 2 Primers’ and probes’ sequences of ddPCR
1.2.2 基因組DNA 提取 將椰毒假單胞菌(CICC10574)接種于LB 液體培養(yǎng)基中,于37℃、220 r/min 搖床過(guò)夜培養(yǎng)。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer Saline,PBS)對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋,至108稀釋度。取各稀釋度菌液1 mL,用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(天根,貨號(hào):A1120)分別提取基因組DNA。操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書,最后,用50 μL TE 緩沖液洗脫提取的基因組DNA。
1.2.3 平板計(jì)數(shù) 取1.2.2 中10 倍梯度稀釋的椰毒假單胞菌純培養(yǎng)菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù),取100 μL 各稀釋度菌液加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)內(nèi),用涂布棒均勻涂開(kāi)后,37℃倒置培養(yǎng)24±2 h,每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行。保證菌落數(shù)在(20-300)CFU 范圍內(nèi)、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng),計(jì)數(shù)結(jié)果取3 個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。
1.2.4 ddPCR 檢測(cè)方法 對(duì)ddPCR 反應(yīng)體系中退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,以確定適宜的PCR 擴(kuò)增程序。以椰毒假單胞菌基因組DNA 為模板,設(shè)置退火溫度在54℃、56℃、58℃、60℃和62℃ 下進(jìn)行ddPCR 擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后,將96 孔板放置到微滴檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果,篩選陽(yáng)性微滴簇和陰性微滴簇分離明顯的溫度為ddPCR 檢測(cè)方法的退火溫度。
采用優(yōu)化后的退火溫度,對(duì)引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定合適的引物和探針濃度。選取引物工作濃度為0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L,探針工作濃度為0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)ddPCR 檢測(cè)結(jié)果選取合適的引物和探針濃度。
ddPCR 反應(yīng)采用20 μL 體系,包括ddPCR 預(yù)混液(10 μL),上、下游引物(2.4 μL,工作濃度為0.6 μmol/L),探針(0.6 μL,工作濃度為0.3 μmol/L),DNA 模板(5 μL),去離子水補(bǔ)足20 μL。將20 μL反應(yīng)體系和60 μL 微滴生成油分別加入到微滴發(fā)生卡對(duì)應(yīng)的孔中,通過(guò)微滴生成儀生成油包水的微滴。將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96 孔板后封膜,將封好的96孔板置于PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 10 min;變性94℃ 30 s,退火加延伸56℃ 1 min,40 個(gè)循環(huán);熱失活98℃ 10min。擴(kuò)增完成后,將96 孔板置于微滴讀取儀進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步讀取結(jié)果并分析。ddPCR 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的菌懸液濃度的換算公式如下:
上式中:C為對(duì)應(yīng)的菌懸液濃度(CFU/mL);c1為核酸拷貝數(shù)濃度(copies/μL);n為反應(yīng)體系中DNA 模板稀釋倍數(shù);v1為提取核酸的最終洗脫體積(μL);v2為提取的菌懸液體積(mL)。
1.2.5 ddPCR 檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證 由于在椰毒假單胞菌中毒事件源頭查找過(guò)程中,易與黃曲霉、枯草芽孢桿菌等常見(jiàn)食源性致病菌混淆,黑龍江“酸湯子”食物中毒事件就曾被誤認(rèn)為是“黃曲霉毒素中毒”[24]。為驗(yàn)證所建立的ddPCR 檢測(cè)方法的特異性,將提取的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照,選取黃曲霉、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌等7 種食源性致病菌(表1)提取的基因組DNA 作為模板,采用1.2.1 節(jié)中設(shè)計(jì)的引物和探針,按照1.2.4 節(jié)中的方法進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.6 qPCR 檢測(cè)方法 qPCR 反應(yīng)體系包括:qPCR預(yù)混液(12.5 μL),上、下游引物(1.5 μL,工作濃度為0.6 μmol/L),探針(0.75 μL,工作濃度為0.3 μmol/L),待測(cè)DNA 模板(5 μL),去離子水補(bǔ)足25 μL。置于LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃ 10 min;變性94℃ 30 s,退火加延伸56℃ 1 min,40 個(gè)循環(huán)。取已知拷貝數(shù)濃度的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程和Ct 值計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)濃度。
1.2.7 人工污染糯米湯樣品的檢測(cè) 糯米湯易被椰毒假單胞菌污染,導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生,選擇糯米湯作為食品基質(zhì)。對(duì)椰毒假單胞菌原菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋并進(jìn)行平板計(jì)數(shù),同時(shí)取104、105、106、107稀釋度菌液各5 mL 分別添加到5 mL 糯米湯中,每個(gè)稀釋度設(shè)置3 個(gè)重復(fù),制成含有不同椰毒假單胞菌添加水平的污染樣品。另取5 mL PBS 加入5 mL 糯米湯中作為陰性對(duì)照。對(duì)不同添加水平的人工污染樣品分別梯度稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。用細(xì)菌基因組試劑盒(天根,貨號(hào):A1120)對(duì)不同添加水平的椰毒假單胞菌污染糯米湯樣品進(jìn)行提取,同時(shí)進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測(cè)。
1.2.8 人工污染糯米湯樣品中ddPCR 檢測(cè)方法特異性的驗(yàn)證 在核酸水平特異性驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,為驗(yàn)證實(shí)際樣品中所建立ddPCR 檢測(cè)方法的特異性,采用椰毒假單胞菌與金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時(shí)污染糯米湯樣品,在4 mL糯米湯樣品中,加入椰毒假單胞菌的濃度梯度為(3×102-3×105)CFU/mL,其他7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。混合均勻后用細(xì)菌基因組試劑盒(天根,貨號(hào):A1120)進(jìn)行提取,并進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)。
為優(yōu)化ddPCR 檢測(cè)方法的退火溫度,將退火溫度分別設(shè)置為54℃、56℃、58℃、60℃和62℃進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1-A 所示,當(dāng)退火溫度為56℃時(shí),陽(yáng)性微滴簇與陰性微滴簇區(qū)分明顯,且各微滴簇較為集中,選擇56℃為椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)的退火溫度。優(yōu)化引物和探針的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-B,引物和探針的工作濃度分別為0.6 μmol/L 與0.3 μmol/L 時(shí),陽(yáng)性微滴簇和陰性微滴簇區(qū)分最為明顯,且微滴簇之間彌散微滴較少,確定該濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的工作濃度。
圖1 ddPCR 方法的退火溫度(A)、引物和探針濃度(B)優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature(A),concentration of primer and probe(B)of ddPCR
由于黃曲霉與椰毒假單胞菌均易污染發(fā)酵玉米面等食品,在檢測(cè)過(guò)程中可能發(fā)生混淆,因此選取黃曲霉作為對(duì)照菌株。此外,還選取了金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌等6 種常見(jiàn)的食源性致病菌(表1),驗(yàn)證所建立的ddPCR 檢測(cè)方法的特異性。以表1中菌株的基因組DNA 作為模板進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示,只有椰毒假單胞菌基因組DNA 被檢測(cè)出陽(yáng)性微滴信號(hào),而其它7 種菌株基因組DNA 檢測(cè)結(jié)果均呈陰性,表明設(shè)計(jì)的引物和探針具有良好的特異性??杀苊馐澄镏卸臼录凡椴≡倪^(guò)程中多種致病菌的干擾,有利于椰毒假單胞菌的準(zhǔn)確檢出。
圖2 椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)方法的特異性結(jié)果Fig.2 Specificity of ddPCR for Pseudomonas cocovenenans
ddPCR 在102稀釋度時(shí),陽(yáng)性微滴的比率為100%,不滿足泊松分布,超出ddPCR 的定量范圍。菌液在(1.53×103-4.13×105)CFU/mL 濃度范圍內(nèi),ddPCR 檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,relative standard deviation)均小于6%,說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性。針對(duì)3.25×102CFU/mL(107稀釋度)菌液進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),RSD 值為16.29%,此時(shí)ddPCR檢測(cè)讀數(shù)結(jié)果為1.38 copies/μL,若濃度更低則無(wú)法檢出。ddPCR 方法的檢出限為3.25×102CFU/mL(表3)。
如表4所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值計(jì)算出的各稀釋度菌液濃度。在(5.42×103-2.75×108)CFU/mL 范圍內(nèi),qPCR 檢測(cè)結(jié)果的RSD 值均小于6%,說(shuō)明該方法重復(fù)性好。qPCR 在106稀釋度時(shí)已超出其檢測(cè)范圍(Ct ≥ 35),檢出限為5.42×103CFU/mL。相比于ddPCR 方法,qPCR 方法的檢出限更高,然而該方法可檢測(cè)到2.75×108CFU/mL 的高濃度菌液,具有更廣泛的檢測(cè)范圍。
為比較3 種檢測(cè)方法的檢出限和靈敏度,根據(jù)平板計(jì)數(shù)法,椰毒假單胞菌原菌液濃度為1.02×109CFU/mL;qPCR 方法在有效檢測(cè)范圍內(nèi),由各稀釋度計(jì)算出的原菌液濃度的平均值為1.1×109CFU/mL;ddPCR 方法計(jì)算出的原菌液濃度為1.2×109CFU/mL。ddPCR 檢測(cè)結(jié)果比平板計(jì)數(shù)結(jié)果高18%,這可能是由于部分細(xì)菌處于存活非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-culturabe,VBNC),該狀態(tài)通過(guò)平板培養(yǎng)方法無(wú)法形成菌落,核酸檢測(cè)可檢出VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌,導(dǎo)致平板計(jì)數(shù)結(jié)果偏低[25-27]。如圖3所示,線段的起止代表不同方法的檢測(cè)范圍,當(dāng)菌液稀釋度低于103(濃度高于4.13×105CFU/mL)時(shí),超出ddPCR 方法的定量范圍,仍可通過(guò)qPCR 方法進(jìn)行定量檢測(cè)。ddPCR 方法的檢出限(3.25×102CFU/mL)低于qPCR 方法(5.42×103CFU/mL)。兩種方法在其檢測(cè)范圍內(nèi)均具有較好的重復(fù)性,ddPCR 方法具有更高的靈敏度,qPCR 方法對(duì)于高濃度的菌液,具有更廣泛的檢測(cè)范圍。
圖3 三種檢測(cè)方法對(duì)不同濃度椰毒假單胞菌檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Different concentration results of P.cocovenenans by 3 detection methods
取104-107稀釋度椰毒假單胞菌菌液添加到糯米湯中,根據(jù)添加菌液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果,人工污染糯米湯樣品中椰毒假單胞菌的添加量為(3.4×102-3.4×105)CFU/mL。對(duì)不同添加量的人工污染糯米湯樣品同時(shí)進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測(cè)以及平板計(jì)數(shù),結(jié)果如圖4所示。ddPCR 對(duì)107稀釋度菌液添加水平仍能檢出,qPCR 不能檢出,ddPCR 具有更高的靈敏度,對(duì)人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL。在各添加水平菌液污染糯米湯樣品的檢測(cè)結(jié)果中,ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的RSD 值均小于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD 值,具有更好的重復(fù)性。此外,從細(xì)菌基因組提取到ddPCR 檢測(cè)可在4 h 內(nèi)完成,平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)時(shí)間需包含細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的時(shí)間,需要至少18 h。與平板計(jì)數(shù)法相比,ddPCR 檢測(cè)方法明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間,有利于食物中毒的快速檢測(cè)分析,從而提高相關(guān)診斷治療的科學(xué)性。
圖4 人工污染樣品中椰毒假單胞菌的定量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Quantitative results of Pseudomonas cocovenenans in artificially contaminated samples
2.2 的結(jié)果表明建立的ddPCR 檢測(cè)方法在核酸水平具有較好的特異性。制備椰毒假單胞菌和金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時(shí)污染的糯米湯樣品,對(duì)該方法在實(shí)際樣品中檢測(cè)的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。在人工污染糯米湯樣品中加入的椰毒假單胞菌濃度為(3×102-3×105)CFU/mL,金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。對(duì)單一(椰毒假單胞菌)和多種食源性致病菌污染的糯米湯樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)并比較其定量結(jié)果。結(jié)果如圖5所示,在椰毒假單胞菌不同水平的污染糯米湯樣品中,添加較高濃度的金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌,對(duì)于椰毒假單胞菌的定量結(jié)果沒(méi)有影響。表明建立的ddPCR 檢測(cè)方法在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中具有較強(qiáng)的抗干擾能力,表現(xiàn)出較好的特異性。
圖5 人工污染樣品中椰毒假單胞菌ddPCR 檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Specificity verification of ddPCR method for the detection of P.cocovenenans in artificially contaminated samples
2020年10月黑龍江省雞西市發(fā)生“酸湯子”食物中毒事件,9 名食用者全部死亡。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查與采樣檢測(cè),在患者胃液及其食用的玉米面中檢出細(xì)菌毒素米酵菌酸,證實(shí)此次食物中毒事件是由椰毒假單胞菌污染產(chǎn)生的米酵菌酸所致[28]。椰毒假單胞菌引起食物中毒的潛伏期是4 h-6 h,初始中毒癥狀包括腹痛、全身無(wú)力、大量出汗、疲倦和嗜睡以及昏迷,在初始癥狀發(fā)作后 2 h-24 h 內(nèi)導(dǎo)致死亡[29]。椰毒假單胞菌污染食品的可能途徑很多,如原材料污染、工廠生產(chǎn)過(guò)程污染等[30-31]。同時(shí),該菌溫度適應(yīng)范圍廣,在26℃-37℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),低溫下也可存活,食物儲(chǔ)存方式不當(dāng)可能導(dǎo)致椰毒假單胞菌污染,其產(chǎn)生米酵菌酸毒素,對(duì)肝臟和腎臟等器官造成嚴(yán)重?fù)p傷,目前仍缺乏特效解毒藥物[3,32]。本研究針對(duì)椰毒假單胞菌高度保守的16S-23S rRNA 序列,優(yōu)化并建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的定量檢測(cè)方法?,F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.29-2020 采用平板培養(yǎng)結(jié)合毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)椰毒假單胞菌進(jìn)行檢測(cè)[33],樣品經(jīng)GVC 選擇性增菌液分離椰毒假單胞菌,該增菌液添加了龍膽紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及氯霉素抑制其他多種革蘭氏陰性菌,再利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)。平板培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng),不利于食物中毒事件中快速確定致病菌并進(jìn)行治療。已有研究表明:細(xì)菌在低溫、紫外線等脅迫條件下可能進(jìn)入存活非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài),VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌仍具有代謝活性,但通過(guò)平板培養(yǎng)不能形成菌落[24,34],因此可能導(dǎo)致平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果偏低。與平板計(jì)數(shù)法相比,數(shù)字PCR 方法可避免檢測(cè)過(guò)程中細(xì)菌VBNC 狀態(tài)的影響。該方法將檢測(cè)時(shí)間由18 h 以上縮短至4 h 以內(nèi),其檢測(cè)結(jié)果的RSD 小于平板計(jì)數(shù)法,顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。
基于PCR 擴(kuò)增技術(shù),已有研究人員建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、熒光定量PCR 法并用于椰毒假單胞菌的檢測(cè),但是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法只能實(shí)現(xiàn)定性分析,熒光定量PCR 法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)[15-16]。目前尚無(wú)針對(duì)椰毒假單胞菌的絕對(duì)定量檢測(cè)方法,本研究采用的數(shù)字PCR 方法不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。該方法通過(guò)將DNA 分子無(wú)限稀釋,使每個(gè)反應(yīng)單元中包含至少一個(gè)拷貝的核酸分子,經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增,通過(guò)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)的單元數(shù)結(jié)合泊松分布的原理計(jì)算目標(biāo)核酸的拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量檢測(cè)。本研究利用數(shù)字PCR 技術(shù),通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立了針對(duì)椰毒假單胞菌核酸的絕對(duì)定量方法。在與其他常見(jiàn)食源性致病菌共同污染樣品的檢測(cè)過(guò)程中,該方法表現(xiàn)出良好的特異性。針對(duì)含不同菌液濃度的人工污染糯米湯樣品,該方法的檢出限為361 CFU/mL,而對(duì)于該濃度的人工污染樣品,qPCR 方法不能檢出,因此數(shù)字PCR 方法具有更高的靈敏度。本研究建立的數(shù)字PCR 方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)快速等特點(diǎn),能夠?yàn)橐炯賳伟目焖贉?zhǔn)確檢測(cè)提供參考,有助于預(yù)防中毒事件的發(fā)生。
本研究依據(jù)椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列,通過(guò)優(yōu)化ddPCR 反應(yīng)條件,建立了基于ddPCR 技術(shù)的定量檢測(cè)方法。該方法具有較好的特異性與準(zhǔn)確性,有利于潛在污染樣品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測(cè),未來(lái)可在食品安全監(jiān)測(cè)與中毒分析等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。