方以勒, 杜唯佳, 林 龍, 康婷婷, 孫靖堯, 莊 儉

(北京化工大學(xué) 機電工程學(xué)院,北京 100029)

0 引 言

隨著世界范圍內(nèi)糖尿病患者人數(shù)以前所未有的速度增長[1],目前的血糖檢測手段是通過刺破手指采集血液,用于比色或酶電化學(xué)測量[2],均屬于非連續(xù)性檢測。微針(microneedle,MN)陣列可以無痛穿透皮膚表皮層到達(dá)真皮層,從而將藥物的滲透率提高幾個數(shù)量級,并可實現(xiàn)微量采樣和檢測功能[3～5]。近年來,對MN作為傳感器和診斷系統(tǒng)的研究不斷深入。Zimmermann S等人研究了空心MN從人的手指中提取組織間質(zhì)液,并使用位于MN陣列下方的酶促電化學(xué)電極檢測了葡萄糖水平[6]；Mukerjee E V等人制備了一個由200個空心硅MN組成的陣列,從人的耳朵中提取組織液[7],用比色法在葡萄糖試紙上進行葡萄糖檢測,滯后時間顯示為6～45 min[8]。然而這幾種方法都是使用MN無創(chuàng)提取組織間液,進行葡萄糖間斷性地檢測。盡管這些電化學(xué)酶基葡萄糖傳感器具有良好的靈敏度、特異性選擇性和較寬的線性范圍的優(yōu)點[5～8],但存在檢測時酶容易脫落、在較高電位下酶容易失活等問題。導(dǎo)電高分子聚3,4—乙烯二氧噻吩(poly 3,4—ethylene dioxythiophene,PEDOT)具有低氧化電位、良好的穩(wěn)定性、高電導(dǎo)率、快速電子轉(zhuǎn)移的特性[9～13],在形成薄膜時可以提供較多的分子包埋位點,利于酶的固定,可作為修飾聚合物MN的材料。

本文提出一種將酶包覆在MN表面修飾材料導(dǎo)電高分子PEDOT中的方法。首先,基于熔融熱壓法制備了聚乳酸(PLA)MN陣列,然后在MN表面修飾導(dǎo)電銀(Ag)層,再采用電沉積法將葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)包埋在PEDOT高分子膜中,用循環(huán)伏安(CV)法和計時電流法測定了傳感器的性能指標(biāo)。

1 傳感器工作原理與設(shè)計

1.1 傳感器工作原理

本文研究的MN葡萄糖傳感器檢測葡萄糖的關(guān)鍵反應(yīng)為酶促反應(yīng)。首先，GOx特異性催化氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖內(nèi)酯和H2O2,然后葡萄糖內(nèi)脂水解生成葡萄糖酸。GOx催化葡萄糖的反應(yīng)可分為兩步,首先FAD得電子生成FADH2(還原型FAD),同時β-D-葡萄糖被氧化生成葡萄糖內(nèi)酯,葡萄糖內(nèi)酯隨后水解生成葡萄糖酸,然后氧化FADH2重新生成FAD,以及H2O2。在第二步反應(yīng)過程中,導(dǎo)電高分子可作為電子受體來代替O2。其電子傳遞過程示意如圖1所示。

圖1 電子傳遞過程

1.2 MN葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)設(shè)計

MN葡萄糖傳感器由內(nèi)至外分為3層。第一層為MN基體層,所用材料為PLA,該材料具有可降解的特性；第二層為惰性金屬層,材料選擇Ag,因其具有較好的導(dǎo)電性能,用于連接外接電路；第三層(最外層)為包覆GOx的導(dǎo)電高分子層。PEDOT導(dǎo)電高分子層通過電沉積法制備，用該法制備PEDOT薄膜時可以很好地將GOx固定。圖2為MN葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)。

圖2 MN葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)

2 MN葡萄糖傳感器的制備

2.1 實驗材料

D-(+)-一水葡萄糖(D-(+)-glucose)、抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)、3,4—乙烯二氧噻吩(EDOT)、苯乙烯磺酸鈉(PSS)、GOx(來源于黑曲霉,凍干粉,大于180 U/mg)。材料均購自上海阿拉丁生化科技有限公司。PLA具有較高的強度,且生物相容性好,由美國NatureWorks公司生產(chǎn),熔點為160 ℃。Ag墨購自上海冪方電子科技有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)自配,實驗所用的水均為超純水。

2.2 實驗儀器

真空干燥箱：型號為DZF—6065,功率為1 400 W,最大真空度為-0.1 MPa,由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡：型號為JTVMS—1510T,放大倍數(shù)為30～200倍,由東莞捷騰公司生產(chǎn)；電化學(xué)工作站：型號為CHI660,由上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)；PrtronicTM微電子打印機：由上海冪方電子科技有限公司生產(chǎn)。

2.3 MN傳感器制備

2.3.1 制備MN陣列

PLA MN的制備流程,如圖3所示。首先,在聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具上鋪滿PLA粒料(圖3(b))；再將模具置于真空干燥箱中,室溫抽真空至真空為-0.1 MPa時,關(guān)閉真空閥；將干燥溫度設(shè)置在205 ℃,干燥30 min；待融化的PLA完全填充模具后,取出模具冷卻,成型的MN進行脫模,得到PLA MN陣列。

圖3 PLA MN微針的制備流程

2.3.2 修飾Ag層

由于PLA材料的低表面能與疏水性,Ag墨不能很好地附著在其表面,因此,首先對上述制備的PLA MN片進行低溫等離子體處理,以提高它的親水性及粘附性。等離子體中的粒子能量大于聚合物材料的結(jié)合鍵能,可以破壞有機大分子的化學(xué)鍵而形成新鍵。但低于高能放射性射線,不會對聚合物材料基質(zhì)造成損傷,所以該方法適用聚合物的表面改性[14]。

將MN片放在玻璃板上,然后用高純氬(Ar)等離子體(放電電壓為5 kV,電極距離為15 mm,氬氣流速為3 L/min,大氣壓)沖擊表面5 min。經(jīng)低溫等離子體處理后,PLA MN片表面接枝了羥基和羧基等親水基團,從而改善了PLA MN片表面的親水性。

修飾Ag層的工藝流程如下：將等離子體處理后的PLA MN片放在微電子打印機的工作臺上,然后輔助設(shè)計軟件BitsAssembler上設(shè)置需要打印的區(qū)域面積(本文實驗為20 mm×20 mm)和Ag層厚度(本實驗設(shè)置為1 μm)。待打印機工作完成后,將MN片放入干燥箱中進行干燥,蒸發(fā)掉Ag墨中Ag的絡(luò)合物與有機醇等雜質(zhì),提高了Ag的純度,從而增加MN電極的導(dǎo)電性。

2.3.3 修飾包覆GOx的導(dǎo)電高分子層

圖4為利用電化學(xué)法在Ag/MN表面聚合導(dǎo)電高分子的實驗流程。首先,取3 mg GOx于10 mL試管中,再用移液槍加入64 μL EDOT溶液;然后,加超純水至3 mL,搖勻混合,所配制EDOT的濃度為0.2 mol/L,GOx的濃度200 IU/mL。稱取12.36 mg PSS粉末,將其轉(zhuǎn)移到試管中,再添加超純水配制成3 mL,搖勻混合,PSS的濃度為0.2 mol/L。將上述兩者溶液倒入反應(yīng)槽中,混合,用玻璃棒攪拌均勻。利用電化學(xué)法對Ag/MN表面進行PEDOT的合成。所施加的工作電位為1 V,聚合時間為10 min。所制備的MN電極記為PEDOT-GOx/Ag/MN。

圖4 電聚合PEDOT時的步驟

3 測試與分析

利用上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)的CHI660電化學(xué)工作站,對MN葡萄糖傳感器進行電化學(xué)測量。自制MN陣列作為工作電極,Ag/AgCl電極和鉑(Pt)片分別用作參比電極和對電極,使用光學(xué)顯微鏡對MN陣列結(jié)構(gòu)進行觀察。

3.1 MN陣列結(jié)構(gòu)的表征

利用光學(xué)顯微鏡觀測PLA MN外形結(jié)構(gòu),如圖5所示。圖5(a)的測量結(jié)果可知,單個MN形狀呈圓錐形,MN平均高度為(548±10) μm,基底直徑和針尖平均直徑分別為(284±15)μm和(60±10)μm。圖5(b)為光學(xué)顯微鏡觀察下的鍍Ag MN結(jié)構(gòu),陣列MN表面Ag層較完整、均勻。

圖5 光學(xué)顯微鏡下的不鍍Ag的PLA、鍍Ag后的PLA MN結(jié)構(gòu)

3.2 循環(huán)伏安特性測試

為了確定PEDOT-G/Ag/MN對葡萄糖的最佳響應(yīng),將修飾好的MN電極陣列浸入15 mmol/L的葡萄糖溶液。給該體系施加掃描范圍為0～1 V、掃描速率為50 mV/s的三角波電壓,進行循環(huán)伏安測試。圖6給出了PEDOT-GOx/Ag/MN在葡萄糖溶液中的CV測試結(jié)果。由圖中可知,該傳感器在0.42 V時對葡萄糖有最佳響應(yīng),即電流達(dá)到峰值2.38 mA,因此取該電位作為后續(xù)的工作電位。

圖6 PEDOT-GOx/Ag/MN在10 mmol/L的葡萄糖溶液中的循環(huán)伏安

3.3 線性范圍與靈敏度測試

首先,將PEDOT-G/Ag/MN浸入PBS緩沖液(溶液體積為100 mL)中；然后，分批次向反應(yīng)槽中加入90 mg葡萄糖粉末(葡萄糖濃度依次為5,10,15,20,25,30,35 mmol/L,整個過程都有磁力攪拌器進行攪拌),使用計時電流法進行連續(xù)響應(yīng)測試,響應(yīng)電流隨時間變化結(jié)果圖7所示。

圖7 傳感器對葡萄糖的連續(xù)響應(yīng)測試

取每個濃度中曲線穩(wěn)定段的平均電流值,對其進行線性擬合,所得擬合曲線方程為y=0.213x-0.706(R2=0.997)。如圖8所示，計算出該MN葡萄糖傳感器的靈敏度S為0.21 mA/(mmol·L-1),設(shè)計的MN傳感器在葡萄糖濃度為5～35 mmol/L中具有良好的線性度。

圖8 MN傳感器對不同葡萄糖濃度的電流響應(yīng)

3.4 響應(yīng)時間測試

將MN傳感器在低濃度溶液里靜止穩(wěn)定一段時間后,向溶液中分2次分別加入9 mg葡萄糖粉末,通過電化學(xué)工作站對響應(yīng)電流的持續(xù)測量,所得響應(yīng)曲線如圖9所示。由曲線變化觀察到,當(dāng)2次向溶液中加入葡萄糖粉末時,響應(yīng)電流分別由5.18 mA迅速上升至8.10 mA,由5.60 mA迅速上升至8.63 mA,后略微下降至5.60 mA和7.10 mA趨于穩(wěn)定。在加入葡萄糖粉末起始階段,靠近MN工作電極的局部葡萄糖濃度迅速上升,隨后因為轉(zhuǎn)子攪拌和物質(zhì)擴散作用,葡萄糖溶液的濃度趨于穩(wěn)定。響應(yīng)時間定義為加入葡萄糖粉末時的極限電流與未加粉末之時的電流的時間間隔,本文設(shè)計的葡萄糖MN傳感器的平均響應(yīng)時間僅為9 s。

圖9 傳感器的響應(yīng)時間測試

3.5 抗干擾性測試

在存在外源性干擾物質(zhì) (如抗壞血酸(AA)、尿酸(UA))的情況下,用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液評估該傳感器的選擇性。這些干擾物具有與葡萄糖相似的氧化電位,可能影響葡萄糖的反應(yīng)信號。所有干擾試驗樣品制備5 mmol/L溶解于PBS中(pH為7.4),進行峰值試驗。在施加電位+0.42 V時,葡萄糖和干擾樣品的電流響應(yīng)變化,如圖10所示。由圖中可知,當(dāng)向溶液體系中分別滴加干擾樣品5 mmol/L AA和5 mmol/L UA時,無明顯電流波動；而當(dāng)增大葡萄糖濃度時,電流迅速上升。這說明設(shè)計的MN傳感器具有較好的特異性選擇葡萄糖性能。

4 結(jié) 論

本文采用PLA材料制備的固體實心MN為基體,并在其上修飾Ag層和導(dǎo)電高分子層來特異性檢測葡萄糖,主要結(jié)論有:

1)用熔融熱壓法制備PLA MN陣列,用打印法修飾Ag層,用電沉積法聚合導(dǎo)電高分子薄膜層。整個傳感器制備流程相對簡便,所需時間少,適合批量生產(chǎn);

2)用PEDOT導(dǎo)電高分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性能夠較好地固定GOx,使得傳感器具有較優(yōu)的性能，該傳感器的線性范圍為0～35 mmol·L-1,靈敏度為0.21 mA/(mmol·L-1),響應(yīng)時間為9 s;

3)該MN葡萄糖傳感器尺寸小,線性度好,可以集成到小型化、便攜化設(shè)備當(dāng)中,為MN無創(chuàng)檢測人體生理指標(biāo)的實際應(yīng)用提供了一定技術(shù)基礎(chǔ)。