沈文婷，秦建品，許 詣

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽市中心醫(yī)院兒科，湖北 襄陽 441021）

氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）的增殖和分泌物的增加已被認(rèn)為是哮喘等阻塞性肺疾病的致病因素，其過度增殖可導(dǎo)致氣道阻塞和支氣管收縮障礙，目前為止還沒有能夠有效抑制其增殖的方法[1]。因此有必要研究抑制ASMCs增殖的機(jī)制。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）在哮喘中的激活是ASMCs細(xì)胞增殖和氣道重塑的主要調(diào)節(jié)劑，抑制其激活可抑制ASMCs細(xì)胞增殖和減緩氣道重塑[2-3]。微小RNA（miRNA）可通過與mRNA 3'-UTR中互補(bǔ)位點(diǎn)相互作用來負(fù)向調(diào)控mRNA的表達(dá)，大量研究[4]已表明，miRNA在哮喘等氣道炎癥疾病中具有重要作用。研究[5]表明miR-339可通過靶向抑制FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）的增殖，但miR-339是否同樣影響氣道平滑肌細(xì)胞的增殖還未可知。在大腸癌中，miR-339-5p可通過抑制p-ERK1/2表達(dá)發(fā)揮抑制癌細(xì)胞生長的作用[6]，但其在ASMCs是否能調(diào)控ERK1/2通路還未見報(bào)道。因此本研究探究了其對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖及ERK1/2通路的影響，以期為研究抑制ASMCs細(xì)胞增殖的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

BCA蛋白檢測試劑盒、MTT檢測試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體、PD98059（貨號(hào)：K12862、BTN111105、WE0381-QAN、M00029-XJT）購自北京百奧萊博科技有限公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（貨號(hào)：0295G-FITC）購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗β-actin、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)、p44/42 MAPK (Erk1/2)、Caspase-3、Bax（貨號(hào)：4970、9101、9102、9661、2772）購自Cell Signaling Technology；兔抗增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、Bcl-2（貨號(hào)：10205-2-AP、12789-1-AP）購自是Proteintech；兔抗c-Myc、CyclinD1抗體（貨號(hào)：ab32072、ab16663） 購 自 abcam；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection試劑盒（貨號(hào)：A211-01/02）購自南京諾唯贊生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c雌性小鼠購自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證：SCXK（鄂）2016-0009，全部實(shí)驗(yàn)大鼠于室溫為23 ℃的室內(nèi)，正常晝夜節(jié)律適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲水采食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ASMCs細(xì)胞增分離、培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠取其支氣管組織，PBS清洗并剪為1 mm 3小塊，胰蛋白酶（0.25%）消化，100目濾網(wǎng)過濾后10 min、1 000 r·min-1離心，加入DMEM培養(yǎng)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，移入培養(yǎng)瓶于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3天更換一次培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至第6代。

1.3.2 ASMCs細(xì)胞鑒定 將所得第6代細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種于24孔板內(nèi)于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)：將已經(jīng)過多聚甲醛（4%）固定的細(xì)胞用胎牛血清封閉2 h，α-actin抗體孵育24 h（1:100，4℃）后添加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG（1:200、1 h），DAPI溶液5 min孵育后PBS沖洗3次，干燥后中性樹脂封片，于熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 ASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種第6代ASMCs細(xì)胞到6孔板中（1×106個(gè)/孔，n= 5），設(shè)置為對(duì)照 組、 模 型 組（5 μg·L-1TGF-β1）、miR-NC 組（miR-NC+5 μg·L-1TGF-β1）、miR-339 mimics 組（miR-339 mimics+5 μg·L-1TGF-β1）、miR-339 mimics+PD98059 組（miR-339 mimics+10 μmol·L-1PD98059+5 μg·L-1TGF-β1），轉(zhuǎn)染并進(jìn)行相應(yīng)處理，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 qRT-PCR檢測miR-339表達(dá) TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)純度及濃度檢測后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行qRT-PCR檢測miR-339表達(dá)量（內(nèi)參：GAPDH），2-ΔΔCt分析 miR-339 表達(dá)水平（n= 5）。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3.5 MTT法檢測ASMCs活力 將各組ASMCs細(xì)胞在96孔板中（1×104個(gè)/孔）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，添加5 g·L-1MTT （10 μL/孔）4 h后，加入DMSO（100 μL）震蕩至結(jié)晶溶解，570 nm處測定吸光度OD值，計(jì)算ASMCs細(xì)胞存活率（%）=（OD處理組/OD對(duì)照組）×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測ASMCs凋亡率 將各組 ASMCs細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè) /mL，與10μL Annexin V-FITC及PI避光孵育（15 min）后流式儀檢測ASMCs細(xì)胞凋亡率（n= 5）。

1.3.7 Western blot檢測ASMCs細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況 RIPA裂解液裂解ASMCs細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)定量、SDS-PAGE電泳、低溫轉(zhuǎn)至PVDF膜上后封閉，加 入 兔 抗 β-actin、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA、Bcl-2、c-Myc、Caspase-3、CyclinD1、Bax 一抗孵育過夜（4℃），次日孵育二抗2 h，蛋白凝膠成像儀定 量 p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA、Bcl-2、c-Myc、Caspase-3、CyclinD1、Bax蛋白含量（n= 5）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05指有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 ASMCs細(xì)胞形態(tài)鑒定

1）倒置顯微鏡下原代ASMCs細(xì)胞圓形胞核位于細(xì)胞中央，整體為梭形或長條形，融合后呈“峰和谷”狀態(tài)；2）α-actin免疫熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈綠色熒光染色，95%為α-actin陽性染色時(shí)可鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為ASMCs細(xì)胞。見圖1、圖2。

圖1 原代ASMCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×200）

圖2 α-actin免疫熒光染色（×200）

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

miR-339表達(dá)水平見表2；熒光顯微鏡觀察ASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果見圖2。

表2 miR-339表達(dá)水平（±s，n= 5）

表2 miR-339表達(dá)水平（±s，n= 5）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05

組別 miR-339對(duì)照組 1.00±0.02 miR-NC組 0.99±0.07 miR-339 mimics組 1.59±0.17#

2.3 各組ASMCs細(xì)胞增殖情況檢測

見圖3、表3。

圖3 ASMCs細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表3 ASMCs細(xì)胞增殖情況檢測（±s，n= 5）

表3 ASMCs細(xì)胞增殖情況檢測（±s，n= 5）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與miR-339 mimics組比較，▲P＜0.05

組別 細(xì)胞存活率 /% c-Myc/β-actin CyclinD1/β-actin PCNA/β-actin對(duì)照組 100.00±00.00 0.91±0.15 1.01±0.11 1.08±0.12模型組 151.13±15.46# 1.66±0.10# 1.71±0.13# 1.74±0.11#miR-NC 組 154.15±16.75 1.64±0.11 1.70±0.14 1.76±0.14 miR-339mimics組 136.82±14.11△ 1.33±0.10△ 1.57±0.10△ 1.48±0.13△miR-339 mimics+PD98059組 123.74±15.98▲ 1.10±0.18▲ 1.28±0.10▲ 1.21±0.10▲

2.4 各組ASMCs細(xì)胞凋亡情況檢測

見表4、圖4、圖5。

表4 各組ASMCs細(xì)胞凋亡情況檢測結(jié)果（±s，n= 5）

表4 各組ASMCs細(xì)胞凋亡情況檢測結(jié)果（±s，n= 5）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與miR-339 mimics組比較，▲P＜0.05

組別 凋亡率 /% Caspase-3/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/β-actin對(duì)照組 25.03±2.19 1.59±0.10 1.55±0.11 0.56±0.20模型組 7.46±1.19# 0.51±0.10# 0.63±0.11# 1.12±0.19#miR-NC 組 7.06±0.10 0.50±0.11 0.59±0.08 1.13±0.21 miR-339 mimics組 12.16±1.91△ 1.11±0.20△ 1.03±0.18△ 0.92±0.17△miR-339 mimics+PD98059組 18.27±2.34▲ 1.35±0.25▲ 1.45±0.21▲ 0.60±0.08▲

圖4 各組ASMCs細(xì)胞凋亡情況

圖5 各組ASMCs細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5 各組ASMCs細(xì)胞內(nèi)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

見表5、圖6。

表5 各組ASMCs細(xì)胞內(nèi)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s，n = 5）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與miR-339 mimics組比較，▲P＜0.05

組別 p-ERK1/2 / ERK1/2對(duì)照組 0.71±0.20模型組 1.72±0.13#miR-NC組 1.74±0.17 miR-339 mimics組 0.95±0.14△miR-339 mimics+PD98059組 0.63±0.10▲

圖6 ASMCs細(xì)胞內(nèi)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

研究[7-8]發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠中，TGF-β1能通過上調(diào)miR-181a表達(dá)來抑制抑癌基因PTEN誘導(dǎo)的ASMCs細(xì)胞增殖。近幾年，關(guān)于miR-339在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，其能夠通過靶向抑制胰島素樣生長因子2-mRNA結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）、FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑、及p38 MAPK信號(hào)通路來抑制PASMC細(xì)胞增殖[5，9]。還有研究[10]發(fā)現(xiàn)，INK4基因座（ANRIL）通過抑制miR-399-5p表達(dá)促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HA-VSMC）增殖和遷移。PCNA與細(xì)胞增殖密切相關(guān)并已被作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其主要表達(dá)于細(xì)胞增殖期[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組ASMCs細(xì)胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2表達(dá)水平顯著增加；與模型組相比，miR-339 mimics組ASMCs細(xì)胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，而Bax、Caspase-3表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著增加。該結(jié)果表明miR-339過表達(dá)能顯著抑制ASMCs細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其有作為哮喘等阻塞性肺疾病潛在治療靶標(biāo)的潛能。

ERK1/2信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，其激活能夠?qū)⒛け砻媸荏w傳至細(xì)胞核，并且被各種生長因子所調(diào)節(jié)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2在ASMCs細(xì)胞中分布廣泛，其參與細(xì)胞的增殖和氣道重塑，其磷酸化水平增加可能導(dǎo)致人氣道平滑?。℉ASM）細(xì)胞增長且數(shù)量增加[2-3，14]。有報(bào)道稱ATP競爭性和功能選擇性ERK1/2抑制劑能有效抑制ASM細(xì)胞中血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、IL-6分泌和膠原蛋白的生成[15]。還有研究[6]表明，miR-339-5p可通過抑制p-ERK1/2表達(dá)發(fā)揮抑癌大腸癌細(xì)胞生長的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與miR-339 mimics組相比，miR-339 mimics+ PD98059組ASMCs細(xì)胞存活率、c-Myc、CyclinD1、PCNA、Bcl-2、p-ERK1/2 / ERK1/2表達(dá)水平顯著降低，而Bax、Caspase-3表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著增加。該結(jié)果表明miR-339對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖和凋亡的影響可能與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。