汪青筑 黎代余 劉洪明

油用牡丹是毛茛科、芍藥屬植物，多年生落葉小灌木。油用牡丹具有較高結(jié)實(shí)率，主要是采收油用牡丹種子、提取油料為目的而種植的牡丹品種或資源類型[1]。具有植株高大、花色艷麗、抗旱耐寒、少病蟲害、結(jié)實(shí)能力強(qiáng)等優(yōu)良特性; 中國(guó)在實(shí)際生產(chǎn)中牡丹品種主要有鳳丹和紫斑 2個(gè)品種[2,3]。油用牡丹是在藥用牡丹(鳳丹) 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的木本油料植物，定植后50年不換茬，堪稱“鐵桿莊稼”[4]。同時(shí)比其他品種牡丹具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和景觀生態(tài)價(jià)值，在改善生態(tài)環(huán)境、增加農(nóng)民收益、對(duì)接精準(zhǔn)扶貧政策等具有重要意義[5,6]。

畢節(jié)位于貴州省西北部，地處川、滇、黔3省結(jié)合部，北亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，平均氣溫13.20 ℃，年降雨量1100 mm左右。氣候及地理?xiàng)l件都非常適宜油用牡丹的生長(zhǎng)[7]。目前，在畢節(jié)地區(qū)引種和推廣的油用牡丹主要以“鳳丹”品種為主。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究油用牡丹的根部(牡丹皮)的成分含量測(cè)定，提高油用牡丹的利用范圍和增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。牡丹皮具有清熱涼血，活血化瘀的功效。用于熱入營(yíng)血，溫毒發(fā)斑，吐血衄血，夜熱早涼，無(wú)汗骨蒸，經(jīng)閉痛經(jīng)，跌撲傷痛，癰腫瘡毒[8]。牡丹皮中主要含有丹皮酚類和芍藥苷類成分[9]。目前用于丹皮酚化學(xué)成分的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[10]、紫外分光光度法[11]、氣相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等。本實(shí)驗(yàn)主要采用高效液相色譜法對(duì)畢節(jié)市不同地方引種油用牡丹進(jìn)行含量測(cè)定，該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

在此基礎(chǔ)上選定黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)、赫章縣六曲河鎮(zhèn)、威寧縣白馬村、畢節(jié)市楊家灣、金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村、百里杜鵑管理區(qū)、織金縣官寨鄉(xiāng)、大方縣雨沖鄉(xiāng)8個(gè)地方的引種牡丹進(jìn)行丹皮酚和芍藥苷的含量測(cè)定，對(duì)促進(jìn)畢節(jié)實(shí)驗(yàn)區(qū)中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展，鄉(xiāng)村振興意義重大。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 牡丹藥材采自黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)、赫章縣六曲河鎮(zhèn)、威寧縣白馬村、畢節(jié)市楊家灣、金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村、百里杜鵑管理區(qū)、織金縣官寨鄉(xiāng)、大方縣雨沖鄉(xiāng)8個(gè)地方，經(jīng)鑒定為毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的根及根皮。見(jiàn)表1。

表1 牡丹藥材

1.1.2 儀器與設(shè)備賽默飛UItiMate 3000 XRS 型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)安捷倫公司)；OHAUS CORPORTION 電子分析天平(十萬(wàn)分之一，美國(guó)OHAUS公司)；超聲機(jī)(上海冠特超聲儀有限公司)

1.1.3 試劑丹皮酚對(duì)照品(批號(hào)：110708-201407，中國(guó)食品藥品檢定研究所)；芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201842，中國(guó)食品藥品檢定研究所)；乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；甲醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丹皮酚含量測(cè)定溶液制備：對(duì)照品溶液制備 取丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含20 μg的溶液，即制得濃度為67.8 μg/ml對(duì)照品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用。供試樣品溶液制備：將收集到的不同產(chǎn)地油用牡丹根皮樣品烘干至質(zhì)量恒定，制粉。取粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz) 30 min，冷卻，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后過(guò) 0.45 μm 的濾膜，濾液為供試樣品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取丹皮酚標(biāo)準(zhǔn) 5 ml、10 ml、15 ml、20 ml和25 ml溶液，并分別置于10.0 ml的容量瓶中，采用甲醇定容，上機(jī)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)(45∶55；柱溫：25 ℃；流速 1.0 ml/min)；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；出峰時(shí)間：4 min；進(jìn)樣量：10 μl；理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。在這一條件下，油用牡丹根皮樣品的液相色譜基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)較多，峰形較好，其中主要成分丹皮酚分離度到規(guī)定要求。見(jiàn)圖1。以標(biāo)準(zhǔn)品含量(C)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到丹皮酚的線性回歸方程和線性范圍。見(jiàn)圖2。

圖1 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品曲線

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn):①精密度。精確吸取丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl注入高效液相色譜儀測(cè)定其峰面積，重復(fù)5次，按照“丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定；②穩(wěn)定性。按照“丹皮酚溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液，精確吸取丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h測(cè)定按照“丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定其峰面積，進(jìn)樣量10 μl，重復(fù)5次；③重復(fù)性。取同一批樣品依法制備6分供試品溶液按照“丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量10 μl，重復(fù)5次；計(jì)算RSD以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的精密度(1.64%)、穩(wěn)定性(2.68%)、重復(fù)性(2.41%)，結(jié)果表明儀器設(shè)備精密度良好，供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn):精密稱取已知丹皮酚含量的丹皮酚樣品5份各0.05 g，再分別精密加入丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品15 ml，按照“丹皮酚溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液后再按照“丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量10 μl，計(jì)算回收率為99.34%和RSD=2.34%，結(jié)果表明該方法的回收率良好。

樣品測(cè)定:精密稱取不同產(chǎn)地油用牡丹樣品 0.5 g，按照“丹皮酚溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液，分別精密吸取樣品溶液各平行3組10 μl注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，計(jì)算不同產(chǎn)地牡丹藥材的丹皮酚含量。見(jiàn)表2。

1.2.2 芍藥苷含量測(cè)定溶液制備:對(duì)照品貯備液 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即制得濃度為65.4 μg/ml對(duì)照品溶液，保存在 4 ℃ 冰箱中備用。供試樣品溶液:將收集到的不同產(chǎn)地油用牡丹根皮樣品烘干至質(zhì)量恒定，制粉。取粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，浸泡4 h，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，冷卻，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過(guò)0.45 μm的濾膜，濾液為供試樣品溶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml和10 ml分別置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，上機(jī)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；出峰時(shí)間：15 min；進(jìn)樣量：10 μl；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。在這一條件下，油用牡丹根皮樣品的液相色譜基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)較多，峰形較好，其中主要成分芍藥苷分離度達(dá)到規(guī)定要求。見(jiàn)圖3。以標(biāo)準(zhǔn)品含量(C)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到芍藥苷的線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖4。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)：①精密度。精確吸取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl注入高效液相色譜儀測(cè)定其峰面積，重復(fù)5次，按照“芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定；②穩(wěn)定性。按照“芍藥苷的溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液，精確吸取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h按照“芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定其峰面積，進(jìn)樣量10 μl，重復(fù)5次；③重復(fù)性。取同一批樣品依法制備6份供試品溶液“芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量10 μl，重復(fù)5次。計(jì)算RSD以評(píng)價(jià)試驗(yàn)的精密度(1.89%)、穩(wěn)定性(2.34%)、重復(fù)性(2.67%)，結(jié)果表明儀器設(shè)備精密度良好，供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知芍藥苷含量的芍藥苷樣品5份各0.05 g，再分別精密加入芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品15 ml，按照“芍藥苷的溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液后再按照“芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下測(cè)定測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量10 μl，計(jì)算回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，結(jié)果表明該方法的回收率良好。

樣品測(cè)定：精密稱取牡丹樣品0.1 g，按照“芍藥苷的溶液制備”項(xiàng)下操作制備溶液，分別精密吸取樣品溶液各平行3組10 μl注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，計(jì)算不同產(chǎn)地牡丹藥材的芍藥苷含量。見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地牡丹藥材含量測(cè)定結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 丹皮酚和芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著丹皮酚含量(C)升高，峰面積(A)呈上升趨勢(shì)，二者存在線性關(guān)系，其直線回歸方程為：y=83.305x+0.9781(R2=0.9996)。表明丹皮酚含量在 0.339～1.695 μg與峰面積有良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。隨著芍藥苷含量(C)升高，峰面積(A)呈上升趨勢(shì)，二者存在線性關(guān)系，其直線回歸方程為：y=19.127x+0.0096(R2=1)。表明芍藥苷含量在 0.1308～0.654 μg與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2 丹皮酚和芍藥苷的含量丹皮酚：精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)丹皮酚樣品溶液的RSD分別為1.64%、2.68%、2.41%，結(jié)果表明儀器設(shè)備精密度良好，供式樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，重復(fù)性良好；加樣回收率(99.34%)和RSD(2.34%)，結(jié)果表明該方法的回收率良好。從表2 可見(jiàn)：不同產(chǎn)地油用牡丹根部丹皮酚的含量：黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)1.84%、赫章縣六曲河鎮(zhèn)2.15%、威寧縣白馬村2.22%、畢節(jié)市楊家灣1.49%、金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村1.57%、百里杜鵑管理區(qū)1.71%、織金縣官寨鄉(xiāng)2.12%、大方縣雨沖鄉(xiāng)2.68%；不同引種地油用牡丹丹皮酚的含量依次：大方縣雨沖鄉(xiāng)>威寧縣白馬村>赫章縣六曲河鎮(zhèn)>織金縣官寨鄉(xiāng)>黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)>百里杜鵑管理區(qū)>金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村>畢節(jié)市楊家灣；丹皮酚的含量最高的是大方縣雨沖鄉(xiāng)，其次是威寧縣白馬村，再次是赫章縣六曲河鎮(zhèn)。從圖3看出，牡丹藥材與丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品在相同的保留時(shí)間下有相同的峰值出現(xiàn)。

圖3 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品和牡丹藥材的HPLC圖

芍藥苷：精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)芍藥苷樣品溶液的RSD分別為1.89%、2.34%、2.67%。結(jié)果表面儀器設(shè)備精密良好，供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，重復(fù)性良好；加樣回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，結(jié)果表明該方法的回收率良好。從表2 可見(jiàn)：不同產(chǎn)地油用牡丹根部芍藥苷的含量：黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)1.47%、赫章縣六曲河鎮(zhèn)1.52%、威寧縣白馬村1.23%、畢節(jié)市楊家灣2.68%、金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村1.69%、百里杜鵑管理區(qū)1.93%、織金縣官寨鄉(xiāng)1.94%、大方縣雨沖鄉(xiāng)2.29%；不同引種地油用牡丹芍藥苷的含量依次：畢節(jié)市楊家灣>大方縣雨沖鄉(xiāng)>織金縣官寨鄉(xiāng)>百里杜鵑管理區(qū)>金沙縣茶園鎮(zhèn)石鐘村>赫章縣六曲河鎮(zhèn)>黔西縣杜鵑街道大興社區(qū)>威寧縣白馬村；芍藥苷的含量最高的是畢節(jié)市楊家灣，其次是大方縣雨沖鄉(xiāng)，再次是織金縣官寨鄉(xiāng)。

從圖4可知，牡丹藥材與丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品在相同的保留時(shí)間下有相同的峰值出現(xiàn)。

圖4 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品和牡丹藥材的HPLC圖

3 結(jié)論

目前，對(duì)油用牡丹的研究主要集中在栽培技術(shù)、產(chǎn)油情況以及其油質(zhì)研究方面，對(duì)其藥材質(zhì)量控制和藥材鑒別相對(duì)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)畢節(jié)市不同引種地油用牡丹藥材質(zhì)量含量測(cè)定。高效液相色譜法具有重現(xiàn)性好、分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，成為藥材與中藥制劑質(zhì)量控制、有效成分及其含量檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的指紋圖譜建立方法[14]。

本研究表明，以丹皮酚為指標(biāo)，流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)(45∶55/V∶V；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)的條件下；油用牡丹藥材質(zhì)量最好的是大方縣雨沖鄉(xiāng)，其次是威寧縣白馬村，再次是赫章縣六曲河鎮(zhèn)；以芍藥苷為指標(biāo)，在流動(dòng)相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)的條件下，油用牡丹藥材質(zhì)量最好的是畢節(jié)市楊家灣，其次是大方縣雨沖鄉(xiāng)，再次是織金縣官寨鄉(xiāng)。最終針對(duì)油用牡丹根皮中的丹皮酚和芍藥苷2種有效成分綜合分析下來(lái)畢節(jié)市大方縣雨沖鄉(xiāng)引種栽培的油用牡丹藥材質(zhì)量最好。

本實(shí)驗(yàn)采集的油用牡丹樣品覆蓋畢節(jié)市管轄的范圍，樣品收集覆蓋范圍較為全面，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果能代表本轄區(qū)油用牡丹藥材的質(zhì)量；可為油用牡丹樣品質(zhì)量控制提供方法支撐，為畢節(jié)市油用牡丹引種與質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)尚未對(duì)油用牡丹根皮中丹皮酚和芍藥苷以外的其他有效成分進(jìn)行質(zhì)量分析測(cè)定，下一步將進(jìn)行深入研究，以得出更為全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)方法可為貴州省27個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈之中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，為畢節(jié)實(shí)驗(yàn)區(qū)中藥材產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、藥材種植和發(fā)展提供參考依據(jù)。