馮 爽，劉少鋒，周佳霖，黃振云，羅仁忠，孫昌志

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510120)

耳蝸缺氧性損傷是新生兒缺氧性腦病常見的并發(fā)癥，可引起中到重度感音神經(jīng)性耳聾。此外，耳蝸組織缺血缺氧，同樣是眾多感音神經(jīng)性耳聾，如噪音性聾、突發(fā)性聾、藥物性聾等的病理生理學機制之一。因此，探索缺氧后耳蝸損傷的機制，對耳聾防治具有重要的臨床治療指導意義。已知聽神經(jīng)元對缺氧十分敏感，缺氧程度越重，持續(xù)時間越長，對聽神經(jīng)元不可逆的損害越嚴重，聽力恢復也越困難。缺氧后可導致耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGN)水腫、壞死，聽神經(jīng)傳入纖維大量崩解及缺失，損傷SGN。SGN的損傷程度與缺氧時間呈正比[1]?？梢奡GN是缺氧引起耳蝸損傷的靶器官之一。最近研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧后可影響聽神經(jīng)元的興奮性。SGN急性缺氧后，可增強其外向鉀電流，促進鉀離子外流到細胞外，使SGN細胞膜電位超極化，影響聽神經(jīng)動作電位發(fā)放頻率[2]?？梢?，缺氧可影響聽神經(jīng)動作電位。缺氧對SGN外向鉀電流的促進過程，主要通過TEA敏感的大電導鈣激活鉀通道電流(BKCa)介導，但對SGN電壓門控性鉀通道(Kv)電流無明顯影響，可能并不作用于Kv電流。然而，在中樞神經(jīng)缺氧后可影響Kv的表達及功能，而且該作用具有亞型特異性的特點，不同的Kv亞型有不同的表現(xiàn)，如缺氧可增大Kv2.1的電流大小，并使其在神經(jīng)元的表達定位發(fā)生變化，使細胞膜電位超極化而抑制神經(jīng)元的興奮性；對于Kv4.2和Kv4.3，缺氧后則降低其在神經(jīng)元的表達，并抑制電流大小，促進細胞膜去極化而增強神經(jīng)元興奮性[3-5]。目前尚不明確缺氧后對SGN Kv表達的作用特點。已知Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1均在SGN表達，可介導聽神經(jīng)動作電位的產(chǎn)生和傳導，確保維持正常聽力[6]。因此，本研究將探討缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表達的特點，明確缺氧對SGN Kv表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠由南方醫(yī)科大學動物中心提供，出生后3～5 d，不論雄雌。

1.2方法

1.2.1SGN的原代培養(yǎng) 大鼠斷頭處死后，取出耳蝸，迅速置于4 ℃ Hank′s平衡鹽溶液中，在立體顯微鏡下，打開耳蝸，剝離螺旋韌帶、血管紋及Corti′s器，將螺旋神經(jīng)節(jié)組織切碎，置入0.25%胰蛋白酶中，37 ℃下孵育10 min。吸去胰酶并終止消化，吹打后收集上清液，離心后再棄去上清液，細胞重懸后，種植到裝有預熱好的DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后，給予缺氧處理。

1.2.2缺氧處理及分組 將載有SGN的培養(yǎng)皿隨機分為對照組和實驗組。對照組置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗組置于缺氧罐內(nèi)(“無氧環(huán)境”下)培養(yǎng)24 h(37 ℃，氣體濃度為95%N2、5%CO2、O2<0.5%)。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) 利用Trizol法分別提取對照組和實驗組細胞的總RNA,隨后將提取到的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，以ACTB為內(nèi)參，在PCR儀上進行擴增，ACTB的上游引物序列為5′- TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3′；下游引物序列為5′- GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′，擴增產(chǎn)物為88 bp。Caspase-3上游引物序列為5′- GAGCTTGGAACGCGAAGAAA-3′，下游引物序列為5′-AGTCCATCGACTTGCTTCCA-3′，擴增產(chǎn)物為112 bp。Kv1.1α亞單位的上游引物序列為5′-GCCGCAGCTCCTCTACTATC-3′，下游引物序列為5′-CCTGCCTGTAGTGGGCTATG-3′，擴增產(chǎn)物為84 bp。Kv1.2α亞單位的上游引物序列：5′-AGTGAGAAGATGTGACGGGAC-3′，下游引物序列為5′-GGAGCTGAGGTTCTCTTCCTTG-3′，擴增產(chǎn)物為85 bp。Kv3.1α亞單位的上游引物序列為5′-TACGGACCCTGCTTCCTCTT-3′，下游引物序列為5′-TGCAAAGATCCTTTCTCATTCCT-3′，擴增產(chǎn)物為76 bp。將擴增完畢的cDNA，按照qPCR法進行定量分析，結(jié)果重復3次。

2 結(jié) 果

2.1缺氧對caspase-3在SGN表達的影響 原代培養(yǎng)的SGN進行無氧處理24 h后，收集細胞。提取全部RNA后，qPCR結(jié)果顯示凋亡執(zhí)行因子caspase-3 mRNA在SGN的表達出現(xiàn)明顯上調(diào)，與對照組相比增加78.3%(n=5,P<0.05)，見圖1。

注：aP<0.05。圖1 無氧處理24 h后SGN caspase-3 mRNA表達上調(diào)

2.2缺氧對Kv在SGN表達的影響 進一步實驗發(fā)現(xiàn),在無氧環(huán)境下，SGN Kv1.1、Kv1.2及Kv3.1α亞單位mRNA表達水平均顯著上調(diào)；與對照組相比，其相對表達量分別增加3.71倍(n=5,P<0.05)、3.59倍(n=5,P<0.05)及4.33倍(n=5,P<0.05)，見圖2～4。

注：aP<0.05。圖2 無氧處理24 h后SGN Kv1.1 α亞基 mRNA表達上調(diào)

注：aP<0.05。圖3 無氧處理24 h后SGN Kv1.2 α亞基 mRNA表達上調(diào)

注：aP<0.05。圖4 無氧處理24 h后SGN Kv3.1 α亞基 mRNA表達上調(diào)

3 討 論

Kv主要由α和β兩種亞單位構(gòu)成。關(guān)于Kv的分類，曾有多種不同分類方法，但各有缺陷。按照最新的分類方法，根據(jù)通道蛋白結(jié)構(gòu)和種系發(fā)生特點，將Kv分為3大類38種亞型[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元對缺氧十分敏感。當出現(xiàn)缺氧后，神經(jīng)元出現(xiàn)短暫的超極化后，神經(jīng)元迅速顯著地去極化，并伴隨鈣離子內(nèi)流，從而使神經(jīng)元過度興奮，加重缺氧引起的神經(jīng)元損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后出現(xiàn)短暫超極化，主要是由于缺氧早期后，大量消耗ATP，對ATP十分敏感的ATP敏感型鉀通道開放，鉀離子外流，細胞膜超極化，這可能有助于防止神經(jīng)元過度興奮而損傷。然而，隨著缺氧的持續(xù)，神經(jīng)元逐漸去極化，出現(xiàn)興奮毒性作用，此過程較為復雜，主要包括兩方面，抑制Kv，減少鉀離子外流，以及促進鈉離子通過電壓門控性鈉通道或其他離子通道大量內(nèi)流。如在海馬神經(jīng)元，缺氧后可使Kv2.1發(fā)生快速可逆的磷酸化反應(yīng)，鉀離子外流減少，使NMDA受體出現(xiàn)過度興奮，介導以鈣離子及鈉離子內(nèi)流為主要特征的興奮毒性作用。因此，有觀點認為，激活Kv有助于防止缺氧后對神經(jīng)元造成的興奮毒性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，氟吡啶作為Kv通道開放劑，可減輕缺氧導致的神經(jīng)組織損傷，部分恢復由缺氧引起的學習及記憶能力受損[8]。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后可使有活性的Kv離子通道增加，電流密度增加[9]。可見在不同部位神經(jīng)元，缺氧后Kv的表現(xiàn)差異較大。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)所有Kv的亞型均在SGN上表達，其中Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN是高表達，主要定位于基底回[6]。Kv1.1、Kv1.2主要介導低電壓激活的外向鉀電流，具有快速激活、快速失活的特點，使細胞膜電位保持在接近動作電位閾值的狀態(tài)，有助于聽神經(jīng)元高頻放電[10]。Kv3.1是介導延時整流外向電流的主要成分，有助于SGN膜電位快速復極化，有利于動作電位的產(chǎn)生，因此也是確保聽神經(jīng)元高頻放電的重要因素[11]。因此，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在基底回高表達的原因，可能是有利于此處SGN易于高頻放電的原因。在本研究中，SGN處于無氧環(huán)境下處理24 h后，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1α亞單位mRNA表達均顯著上調(diào)，說明長時間嚴重缺氧，可上調(diào)Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN的表達。由此可推測，增加神經(jīng)元放電頻率，將影響聽神經(jīng)動作電位的傳導，這可能是其引起聽力下降的機制之一。

然而，本研究結(jié)果與既往文獻報道的結(jié)果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧(無氧處理5～15 min)后SGN的TEA敏感的BKCa電流大小增加，而4-AP敏感的Kv則無明顯改變，因此認為介導缺氧對外向鉀通道電流作用的主要是BKCa，認為Kv可能不參與此過程[2]。結(jié)合本研究結(jié)果，分析產(chǎn)生差異的原因，可能與缺氧處理時間不同有關(guān)。在本研究中，SGN持續(xù)處于無氧環(huán)境下24 h，屬于長期嚴重缺氧；而文獻報道的無氧狀態(tài)最長僅維持15 min，屬于短期急性缺氧。缺氧時間的不同，可能對SGN不同類型鉀通道有不同的作用。推測在缺氧早期，主要影響SGN BKCa的功能，隨著缺氧持續(xù)時間的延長，可能進一步影響Kv的表達，共同促使細胞膜電位超極化，抑制SGN放電，影響聽覺動作電位。

本研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧后可以增加caspase-3的表達，這說明缺氧可促進SGN凋亡過程，導致SGN損傷。既往有研究發(fā)現(xiàn)，Kv與凋亡過程有關(guān)。如通過調(diào)控細胞膜表面Kv1.1及Kv1.3的表達及其電生理學特性，增加開放頻率，促進鉀離子外流，使胞質(zhì)鉀離子濃度降低，細胞內(nèi)容量降低，細胞皺褶，引起細胞凋亡過程[12]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，敲除Kv1.1在細胞的表達，可增加抑制-Bcl的表達；而敲除Kv1.3，則減少caspase-3和促凋亡因子Bad的表達?？梢娫诘蛲鲞^程中，Kv可影響caspase-3等凋亡相關(guān)因子的表達，從而影響凋亡過程[13]。因此，推測缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表達增加，增加鉀離子外流，可能引發(fā)caspase-3介導的細胞凋亡過程，加重SGN的損傷，這有待進一步研究證實。