才昊 欒梅 趙德福 (錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 000；老年科)

帕金森病是我國常見的老年病之一，是一種臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變〔1,2〕。帕金森病高發(fā)人群為老年及體弱群體〔3〕。帕金森病患者一旦患病，常會表現(xiàn)出運(yùn)動障礙、四肢失控等癥狀，對于患者的日常生活及家庭壓力均造成嚴(yán)重的影響〔4,5〕。但現(xiàn)如今對于其發(fā)病機(jī)制還未研究透徹，一些針對性的治療也未能達(dá)到理想效果。微小RNA(miRNA)在帕金森病發(fā)生發(fā)展過程中極為重要〔6〕，本研究探討沉默miR-331-5p對帕金森病大鼠的干預(yù)效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由江蘇艾菱菲生物科技提供，8～10月齡，平均(8.9±0.8)個月；體重231～245 g，平均體重(238.2±4.9)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.2±2.3)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。

主要試劑：兔抗小鼠miR-331-5p抗體(Dako公司)；大鼠抗小鼠蘇氨酸蛋白磷酸酶(PHLPP)1抗體(Hyclone公司)；小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-3、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Selleck公司)；兔抗大鼠過氧化氫酶(CAT)、終末氧化蛋白(AOPP)抗體(BD公司)；小鼠抗兔因子重組人自噬效應(yīng)蛋白(Beclin)-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3-Ⅱ抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔雷帕霉素機(jī)械靶蛋白(mTOR)抗體(Gibco公司)。

1.2建模及分組干預(yù) 隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，不做處理。剩余30只建立帕金森病模型：將魚藤酮在葵花油乳油中溶解，濃度2 mg/ml，之后對大鼠進(jìn)行頸背部皮下注射，劑量2 mg/(kg·d)，1次/d，連續(xù)注射28 d。對大鼠行為學(xué)進(jìn)行觀察檢測，大鼠肢體僵直、震顫、步態(tài)不穩(wěn)、行動遲緩可視為建模成功，共建模成功25只。將25只帕金森病模型大鼠隨機(jī)分為模型組9只及上調(diào)組、沉默組各8只，上調(diào)組尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-331-5p，沉默組尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-331-5p，正常組、模型組尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.3指標(biāo)監(jiān)測 (1)學(xué)習(xí)記憶能力檢測：參考李巖〔7〕的研究開設(shè)水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。記錄各組大鼠逃避潛伏期時間及穿越平臺次數(shù)。(2)標(biāo)本制備、蘇木素-伊紅(HE)染色：各組大鼠麻醉后行斷頭法處死，取其腦組織，于4%甲醛中浸泡固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋后行連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，封片后，通過高倍顯微鏡對其進(jìn)行觀察，對神經(jīng)元大小進(jìn)行統(tǒng)計。(3)miR-331-5p表達(dá)檢測：RT-PCR檢測miR-331-5p表達(dá)，內(nèi)參U6。(4)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)檢測：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平，詳細(xì)檢測步驟見說明書。(5)PHLPP1及自噬、凋亡蛋白表達(dá)檢測：使用Western印跡檢測PHLPP1及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、凋亡蛋白PI3K、mTOR相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理學(xué)觀察 正常組腦組織細(xì)胞較為平整，細(xì)胞排列較為規(guī)則；模型組及上調(diào)組腦組織細(xì)胞存在大量破裂、腫脹等異常表現(xiàn)，細(xì)胞排列紊亂；沉默組細(xì)胞存在些許破裂、腫脹表現(xiàn)，細(xì)胞排列較為規(guī)律。見圖1。

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE染色，×400)

2.2各組miR-331-5p、PHLPP1表達(dá)對比 模型組、上調(diào)組、沉默組miR-331-5p、PHLPP1表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)；且沉默組miR-331-5p、PHLPP1表達(dá)明顯低于模型組、上調(diào)組(P<0.05)。見表1。

2.3各組學(xué)習(xí)記憶能力變化情況 模型組、上調(diào)組、沉默組第1、3、5天時逃避潛伏期均明顯長于正常組，穿越平臺次數(shù)均明顯少于正常組(P<0.05)；且沉默組第1、3、5天時逃避潛伏期均明顯短于模型組、上調(diào)組，穿越平臺次數(shù)均明顯多于模型組、上調(diào)組(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-331-5p、PHLPP1表達(dá)、學(xué)習(xí)記憶能力

2.4各組兩側(cè)神經(jīng)元大小比較 模型組、上調(diào)組、沉默組左側(cè)及右側(cè)神經(jīng)元均明顯小于正常組(P<0.05)；且沉默組左側(cè)及右側(cè)神經(jīng)元均明顯大于模型組與上調(diào)組(P<0.05)。見表2。

表2 各組兩側(cè)神經(jīng)元大小比較

2.5各組炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)比較 模型組、上調(diào)組、沉默組CAT水平明顯低于正常組，IL-3、TNF-α、AOPP水平明顯高于正常組(P<0.05)；且沉默組CAT水平明顯高于模型組與上調(diào)組，IL-3、TNF-α、AOPP水平明顯低于模型組與上調(diào)組(P<0.05)。見表3。

2.6各組自噬、凋亡蛋白相對表達(dá)比較 模型組、上調(diào)組、沉默組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯高于正常組，PI3K、mTOR相對表達(dá)量明顯低于正常組(均P<0.05)；沉默組Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達(dá)量明顯低于模型組與上調(diào)組，PI3K、mTOR相對表達(dá)量明顯高于模型組與上調(diào)組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、凋亡蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 Western印跡檢測自噬、凋亡蛋白表達(dá)

3 討 論

帕金森病屬于神經(jīng)科疾病，且主要發(fā)病于老年弱勢群體中，年齡因素、環(huán)境因素、家庭遺傳因素等均為帕金森病癥狀發(fā)病危險因素〔8，9〕。帕金森病患者一般病癥主要表現(xiàn)為運(yùn)動及精神的障礙，會對患者的健康及生活均造成嚴(yán)重的影響〔10，11〕。至今為止尚無一種特效的治療帕金森病的手段，且關(guān)于其發(fā)病機(jī)制臨床也未研究清晰，基于此，對于其發(fā)病的機(jī)制研究為重中之重〔12,13〕。

miRNA與炎癥反應(yīng)、微生物感染、免疫系統(tǒng)變化等生物學(xué)行為密切相關(guān)〔14,15〕。miR-331-5p為miRNA家族的重要組成部分，有研究表示，miR-331-5p在帕金森病中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且其表達(dá)變化與帕金森病癥狀嚴(yán)重程度具有密切聯(lián)系〔16〕。PHLPP1具有高度保守性，其表達(dá)變化參與細(xì)胞增殖、凋亡、黏附等多種生物學(xué)過程。本研究結(jié)果顯示，miR-331-5p、PHLPP1在帕金森病大鼠中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，沉默miR-331-5p表達(dá)的帕金森病大鼠PHLPP1也隨之下降，分析其原因?yàn)槌聊琺iR-331-5p能夠通過調(diào)控PHLPP1表達(dá)來抑制帕金森病大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

大量實(shí)驗(yàn)研究表示，帕金森病的發(fā)生發(fā)展對機(jī)體神經(jīng)功能、認(rèn)知功能造成嚴(yán)重?fù)p傷〔17〕。余恒等〔18〕在研究中通過水迷宮實(shí)驗(yàn)對帕金森病模型大鼠神經(jīng)功能、認(rèn)知功能變化情況，表明正確且有效的干預(yù)方法能夠更好保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，從而顯著提升大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果說明帕金森病模型大鼠神經(jīng)功能受到一定損傷，沉默miR-331-5p表達(dá)能夠起到一定神經(jīng)損傷保護(hù)作用，從而提升大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

機(jī)體炎癥狀態(tài)及氧化應(yīng)激反應(yīng)與帕金森病發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)〔19,20〕。IL-3、TNF-α、CAT、AOPP即為臨床上常用于評價機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激狀態(tài)的指標(biāo)。本研究結(jié)果說明沉默miR-331-5p表達(dá)能夠調(diào)控IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平，能夠有效改善大鼠體內(nèi)的炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)。

帕金森病發(fā)生發(fā)展伴隨著腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬、凋亡〔21,22〕。Beclin-1、LC3-Ⅱ、P13K、mTOR反映帕金森病患者的細(xì)胞自噬及凋亡狀況。本文研究結(jié)果顯示，沉默miR-331-5p表達(dá)的帕金森病大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ、P13K、mTOR受到明顯調(diào)控，說明沉默miR-331-5p能夠有效抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞的自噬及凋亡，有效緩解大鼠的神經(jīng)損傷情況。

綜上，沉默帕金森病大鼠miR-331-5p表達(dá)，對于大鼠的神經(jīng)元具有較好的改善效果，從而提升學(xué)習(xí)及記憶能力，緩解大鼠體內(nèi)炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)，對腦組織細(xì)胞的自噬、凋亡，從而起到神經(jīng)元保護(hù)作用。