杜建青 汪立 吳忠隱 張弘 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科，河北 承德 067000)

血栓閉塞性脈管炎(TAO)是一種炎癥性血管疾病，主要影響四肢中的中小型血管，其主要病理生理改變?yōu)橹車苎装Y和閉塞，臨床輕癥表現(xiàn)為四肢受損，重癥可出現(xiàn)肢體潰瘍，迫使患者截肢，但其傳統(tǒng)治療效果并不理想〔1〕。血塞通主要成分是五加科人參屬植物三七提取物，用于心腦血管疾病的治療，具有抑制血小板凝聚、降低血液黏稠度、抑制血栓形成的作用，聯(lián)合低分子肝素能明顯改善大隱靜脈曲張高位結(jié)扎剝脫術(shù)患者術(shù)后血液高凝狀態(tài)，有效減少深靜脈血栓形成〔2〕，還可通過下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號(hào)通路，抑制缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔3〕。STAT3信號(hào)通路可參與細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學(xué)進(jìn)程，白細(xì)胞介素(IL)-6為其上游因子，而IL-6表達(dá)的增加可進(jìn)一步激活Janus激酶(JAK)2/STAT3信號(hào)通路〔4〕。另外，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性，可降低血管炎大鼠人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管組織中炎性因子的表達(dá)，減輕大鼠肢體損傷〔5〕。但血塞通是否調(diào)控IL-6/STAT3通路對(duì)TAO大鼠起保護(hù)作用，目前尚未有報(bào)道。本研究采用月桂酸鈉注射法構(gòu)建TAO大鼠模型，使用血塞通和STAT3激活劑Colivelin干預(yù)該模型，旨在從IL-6/STAT3通路揭示血塞通對(duì)TAO大鼠的保護(hù)作用，為血塞通在臨床上對(duì)TAO的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠(75只，雄性，體重200～220 g)購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0003，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定。按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 血塞通(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021486)購(gòu)自云南維和藥業(yè)股份有限公司；Colivelin(STAT3激活劑，在體外和體內(nèi)增加STAT3的磷酸化，規(guī)格：1 mg，產(chǎn)品編號(hào)：sc-361153)，購(gòu)自MCE公司。

1.1.3主要試劑和儀器 大鼠血栓形成素(TX)B2、6-酮-前列腺素(6-Keto-PG)F1α、纖維蛋白原(Fg)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)-1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) ，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-actin鼠抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白提取試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、JAK2、STAT3和磷酸化(p)-STAT3鼠抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀Fax-20100購(gòu)自美國(guó)INStat公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海普赫生物科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購(gòu)自山東三瑞科技有限公司。

1.2方法

1.2.1TAO大鼠模型的建立及分組 采用月桂酸鈉注射法〔6〕構(gòu)建TAO大鼠模型：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剔除左下肢股內(nèi)側(cè)毛發(fā)，2%碘伏消毒皮膚，于腹股溝中點(diǎn)至膝內(nèi)側(cè)縱行長(zhǎng)為1.5～2.0 cm切口，依次分離皮下組織，游離股動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈近心端，阻斷血流，于動(dòng)脈夾下方遠(yuǎn)心端注入0.2 ml 10 mg/ml月桂酸鈉溶液(假手術(shù)組注射0.2 ml生理鹽水)，當(dāng)血管明顯充盈，略顯白色但無(wú)明顯腫脹時(shí)，輕柔取針。注射15 min后松開動(dòng)脈夾，檢查確保無(wú)活動(dòng)性出血后，即可縫合皮膚，各組大鼠術(shù)后均腹腔注射青霉素預(yù)防感染。造模完成當(dāng)日，大鼠患肢足爪處變蒼白，甚至青紫，次日患肢足趾變黑，有形成壞疽和木乃伊化的趨勢(shì)則證明造模成功〔7〕。將造模成功的60只大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、血塞通組(灌胃50 mg/kg〔8〕)、Colivelin組(STAT3激活劑Colivelin〔9〕，1 mg/kg，腹腔注射)、血塞通+Colivelin組(灌胃50 mg/kg血塞通同時(shí)腹腔注射1 mg/kg STAT3激活劑Colivelin)，每組15只，另取15只大鼠為假手術(shù)組。假手術(shù)組和模型組大鼠給予等劑量生理鹽水，各組每天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.2.2觀察并評(píng)價(jià)大鼠基本情況和病變程度 末次給藥結(jié)束后，觀察大鼠患肢處皮膚顏色、有無(wú)腫脹、壞疽及壞疽程度。根據(jù)大鼠患肢情況，將病變程度分為以下級(jí)別：0級(jí)表現(xiàn)為正常，Ⅰ級(jí)表現(xiàn)為僅趾甲部出現(xiàn)病變，Ⅱ級(jí)表現(xiàn)為僅趾部出現(xiàn)病變，Ⅲ級(jí)表現(xiàn)為足爪部出現(xiàn)病變，Ⅳ級(jí)表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)以下出現(xiàn)病變，Ⅴ級(jí)表現(xiàn)為病變發(fā)展到膝關(guān)節(jié)以上，觀察統(tǒng)計(jì)各組大鼠出現(xiàn)上述不同級(jí)別病變的只數(shù)。

1.2.3HE染色觀察各組大鼠股動(dòng)脈組織病理學(xué)變化 上述1.2.2觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉實(shí)施安樂死，股動(dòng)脈取血約5 ml，分離血清后置于4℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA檢測(cè)。取各組大鼠患肢處注射月桂酸鈉以下部位的股動(dòng)脈組織(包括動(dòng)脈和靜脈主干)，其中5只大鼠該部位組織迅速置于4%多聚甲醛中固定(剩余10只大鼠該部位迅速置于-80℃冰箱，用于后續(xù)ELISA，另取所有大鼠患處肌肉組織迅速置于-80℃冰箱，用于后續(xù)Western印跡檢測(cè))，然后高濃度到低濃度乙醇脫水、二甲苯透明，最后進(jìn)行石蠟包埋，采用切片機(jī)做常規(guī)病理切片，按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組股動(dòng)脈組織病理學(xué)變化。

1.2.4ELISA法檢測(cè)各組血栓形成因子及內(nèi)皮功能相關(guān)因子含量 取出上述1.2.3中置于4℃冰箱的各組大鼠血清及-80℃冰箱中的股動(dòng)脈組織，分別采用TXB2、6-Keto-PGF1α、Fg、NO、ET-1和VEGF ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作步驟分別檢測(cè)各自含量。

1.2.5Western印跡檢測(cè)各組IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平 取上述1.2.3中置于-80℃冰箱中的各組患側(cè)肌肉組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取50 g蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉(zhuǎn)膜、抗體封閉、1∶1 000濃度稀釋后的IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3鼠抗4℃過夜孵育、置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶2 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各組蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠基本情況和病變程度比較 假手術(shù)組大鼠基本正常，無(wú)明顯病變，15只均為0級(jí)；模型組大鼠患肢足爪或蒼白或青紫或暗灰，有跛行或曳行現(xiàn)象，病變程度多處于Ⅳ級(jí)(9只)，Ⅴ級(jí)2只，Ⅲ級(jí)4只。與模型組相比，血塞通組大鼠上述病變明顯減輕，病變程度多為Ⅰ級(jí)(9只)，0級(jí)5只，Ⅱ級(jí)1只；Colivelin組上述病變情況明顯加重，病變程度多為Ⅴ級(jí)(8只)，Ⅳ級(jí)5只，Ⅲ級(jí)2只。血塞通+Colivelin組大鼠病變程度(Ⅳ級(jí)7只，Ⅲ級(jí)5只，Ⅱ級(jí)2只，Ⅴ級(jí)1只)較血塞通組加重，較Colivelin組減輕。

2.2各組股動(dòng)脈組織病理學(xué)變化比較 假手術(shù)組股動(dòng)脈組織血管形態(tài)完整，無(wú)明顯病理現(xiàn)象；模型組股動(dòng)脈組織血管有大量血栓形成，內(nèi)皮細(xì)胞脫落嚴(yán)重。與模型組相比，血塞通組股動(dòng)脈組織血管及內(nèi)皮細(xì)胞病理現(xiàn)象明顯減輕；Colivelin組股動(dòng)脈組織血管及內(nèi)皮細(xì)胞病理現(xiàn)象明顯加重。血塞通+Colivelin組股動(dòng)脈組織病理現(xiàn)象較血塞通組加重，較Colivelin組減輕。見圖1。

圖1 各組股動(dòng)脈組織病理變化(HE染色，×100)

2.3各組血清中血栓形成因子含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組血清中TXB2和Fg含量顯著升高，6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，血塞通組血清中TXB2和Fg含量顯著降低，6-Keto-PGF1α含量顯著升高(P<0.05)；與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組血清中TXB2和Fg含量顯著升高，6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P<0.05)；與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組大鼠血清中TXB2和Fg含量顯著降低，6-Keto-PGF1α含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中血栓形成因子含量、IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)水平及STAT3磷酸化水平比較

2.4各組股動(dòng)脈組織中內(nèi)皮功能相關(guān)因子含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組股動(dòng)脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，血塞通組股動(dòng)脈組織內(nèi)中NO含量顯著升高，ET-1和VEGF含量顯著降低(P<0.05)；Colivelin組股動(dòng)脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)。與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組股動(dòng)脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)；與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組股動(dòng)脈組織中NO含量顯著升高，ET-1和VEGF含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組內(nèi)皮功能相關(guān)因子含量比較

2.5各組患側(cè)肌肉中IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)水平及STAT3磷酸化水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，血塞通組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化水平顯著降低(P<0.05)，Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達(dá)及STAT3磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。見表1和圖2。

1～5：假手術(shù)組、模型組、血塞通組、Colirelin組、血塞通+Colivelin組圖2 各組IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3、p-STAT3水平表達(dá)

3 討 論

TAO是一種影響四肢小血管的非動(dòng)脈粥樣硬化炎癥性疾病，病變主要累及四肢及遠(yuǎn)端中小動(dòng)靜脈，病理表現(xiàn)為出現(xiàn)大量浸潤(rùn)性血栓、炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能障礙，臨床表現(xiàn)為患肢缺血、疼痛、發(fā)涼，麻木等〔10〕。

隨著對(duì)中醫(yī)藥的不斷研究，人們發(fā)現(xiàn)以三七皂苷為主要成分的血塞通具有活血祛瘀，通脈活絡(luò)，增加腦血流量的作用。Zhao等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)血塞通注射液可用于治療心腦血管疾病，具有保護(hù)心血管，減輕心肌缺血/再灌注損傷的作用。在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用注射用血塞通可減少大腦中動(dòng)脈粥樣硬化性引起的微血栓，可降低缺血性事件發(fā)生率，且未產(chǎn)生不良反應(yīng)的發(fā)生〔12〕。而塞通分散片已被臨床證實(shí)是治療心腦血管疾病的有效藥物〔13〕。多種炎癥性血瘀患者體內(nèi)Fg、TXB2和ET-1含量顯著增加，6-Keto-PGF1α表達(dá)量顯著降低〔14，15〕，抑制ET水平，提高NO水平，可緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙〔16〕。Zhang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)降低股動(dòng)脈中TXB2、ET-1和TNF-α表達(dá)，增加6-Keto-PGF1α的表達(dá)，可改善TAO大鼠股動(dòng)脈病理特征。提示血塞通可緩解TAO大鼠內(nèi)皮血管功能障礙，對(duì)TAO大鼠起保護(hù)作用，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

STAT3為一類由750～800個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，參與腫瘤的增殖、分化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等生理功能的調(diào)控。Liu等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3通路可誘發(fā)小鼠漿細(xì)胞乳腺炎，Wei等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3通路的激活可通過引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙參與TAO的發(fā)病機(jī)制，而抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路可減輕炎癥損傷〔20〕。本研究提示，血塞通可能通過抑制IL-6/STAT3通路，對(duì)TAO大鼠起保護(hù)作用。本研究提示，血塞通對(duì)TAO大鼠的保護(hù)作用可被STAT3激活劑Colivelin逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步揭示血塞通可能通過抑制IL-6/STAT3通路，保護(hù)TAO大鼠。

綜上所述，血塞通可通過抑制IL-6/STAT3通路，緩解TAO大鼠血管內(nèi)皮功能障礙，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)TAO大鼠起保護(hù)作用。然而TAO病理過程可能涉及其他機(jī)制，因此血塞通的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步完善。