趙偉國 張海勇 唐蕾 辛玲 高珊 李運(yùn)景 (中山市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 中山 528403)

菌毒清顆粒是中山市人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由板藍(lán)根、穿心蓮、金銀花等多味藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝精制而成，具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛抗感染、涼血養(yǎng)陰、降火利咽等功效，治療流行性感冒、咽炎、上呼吸道感染等臨床應(yīng)用效果較好〔1～3〕。鼻咽癌是我國南方地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其病情隱匿，惡性程度高并且較早地發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔4,5〕。

早期患者常采用放射治療就能取得較好的療效，但中晚期患者常以化療為主。目前臨床使用的抗腫瘤化療藥物毒副作用較大，臨床應(yīng)用受到了極大限制〔6,7〕。如何降低抗腫瘤藥物的毒副作用，已成為臨床亟待解決的主要問題。研究發(fā)現(xiàn)，菌毒清對抗呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒(ADV)及柯薩奇病抗病毒CoxB3等具有廣泛的藥理作用〔8～10〕。菌毒清應(yīng)用過程中，有臨床醫(yī)生反應(yīng)，早期鼻咽癌患者長期服用菌毒清顆粒能改善相關(guān)癥狀，因此推測菌毒清可能具有抗鼻咽癌的潛在作用。但是關(guān)于菌毒清對鼻咽癌細(xì)胞的基礎(chǔ)研究鮮有報道。本研究探討菌毒清提取物對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2凋亡影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1一般材料 人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2均購于中科院上海細(xì)胞庫。菌毒清提取物的制備：先取穿心蓮用85%乙醇滲漉提取，滲漉液回收乙醇，濃縮成稠膏；另取其余各藥去雜質(zhì)，洗凈，加水，煎煮2次，每次1.5 h，煎液過濾、離心后，濃縮成稠膏,再與穿心蓮稠膏合并，混合均勻，低溫干燥既得。將咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2分別分為4組：對照組、1.0、2.0、3.0 ng/ml菌毒清處理組。

1.2主要試劑和儀器 完全RPMI1640培養(yǎng)基(凱基生物 KGM31800S-500)；胎牛血清(BI生物有限公司，1552680)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(AP101-100-kit)、細(xì)胞周期染色試劑盒(CCS102)均購自聯(lián)科生物；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(IPVH00010， Millipore)；超敏發(fā)光液(RJ239676，賽默飛)；大分子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-xl(ab32370)；髓樣細(xì)胞白血病蛋白(Mcl)-1 抗體(ab32087)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(ab184787)、Caspase-8抗體(ab25901)、Caspase-9抗體(ab32539)均購自Abcam公司；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀(2060R)購自艾森生物(杭州)有限公司；顯微鏡(CX41 OLYMPUS公司)；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3CCK8檢測 棄去培養(yǎng)上清，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，0.25%胰酶〔含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化3 min，加入培養(yǎng)基終止消化并懸起細(xì)胞；收集細(xì)胞至10 ml離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄盡上清，加入培養(yǎng)基用吸管吹勻；將上述細(xì)胞懸液稀釋至適宜細(xì)胞密度后加入96孔板中，每孔100 μl。于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行加藥處理。棄上清，96孔板加入配置好的含藥培養(yǎng)基，到達(dá)藥物處理時間后，每孔加10 μl CCK8檢測試劑，在37℃孵育2 h；酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的OD值計(jì)算存活率。

1.4細(xì)胞遷移 細(xì)胞按照“1.3”處理，直尺和marker筆在操作前紫外照射30 min(超凈臺內(nèi))。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著孔的正中央，均勻地劃橫線，橫穿過孔。在空中加入約5×105個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下對細(xì)胞劃線部分進(jìn)行拍照。

1.5細(xì)胞侵襲 細(xì)胞按照“1.3”處理，常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞，用低血清DMEM培養(yǎng)液〔含0.2%胎牛血清(FBS)〕混懸成密度為5×105/ml的單細(xì)胞懸液。將Transwell培養(yǎng)池放入24孔培養(yǎng)板中，上室內(nèi)加入100 μl細(xì)胞懸液(約5×104細(xì)胞)，下室內(nèi)加入500 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。置于5% CO2，37℃孵箱培養(yǎng)24 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內(nèi)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20～30 min，PBS洗2次，0.1 %結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。

1.6細(xì)胞流式凋亡檢測 細(xì)胞按照“1.3”處理，收集1×106～3×106個細(xì)胞，加1 ml PBS 1 500 r/min離心3 min，洗2遍。用雙蒸水將5×結(jié)合緩沖液稀釋為1×結(jié)合緩沖液。取300 μl 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。每管各加入3 μl Annexin V-FITC和5 μl PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μl 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液?；靹蚝笊狭魇絻x檢測。

1.7Western印跡 取各組細(xì)胞加入組織裂解液，裂解30 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4℃孵育一抗過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。利用“Quantity one”軟件進(jìn)行各抗體條帶灰度值的分析。

1.8熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 取各組細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，提取RNA后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，算出各組細(xì)胞中Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度菌毒清提取物對各組細(xì)胞活力的影響 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度菌毒清提取物處理CNE-1和CNE-2細(xì)胞后，處理12 h和24 h后，2.0、3.0 mg/ml組細(xì)胞活力與對照組相比顯著降低(P<0.05)，處理48 h和72 h后，1.0、2.0、3.0 mg/ml組與對照組相比均顯著降低(均P<0.05)。提示隨著菌毒清提取物濃度的增加對細(xì)胞活力的抑制率在逐漸升高。見表2。

表2 不同濃度菌毒清提取物對各組CNE-1、CNE-2細(xì)胞活力的影響

2.2不同濃度菌毒清提取物對各組細(xì)胞遷移的影響 通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，對不同濃度的菌毒清提取物處理24 h后的各組細(xì)胞的遷移情況見圖1。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物均能顯著性抑制細(xì)胞發(fā)生的遷移，且隨著濃度的增加，抑制細(xì)胞遷移的效果越明顯(P<0.05)。見表3。

圖1 不同濃度菌毒清提取物處理后CNE-1、CNE-2細(xì)胞遷移情況(×40)

2.3不同濃度菌毒清提取物對各組細(xì)胞侵襲的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細(xì)胞處理24 h后，通過結(jié)晶紫染色的方法對各組細(xì)胞的侵襲情況見圖2。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物均能顯著性抑制細(xì)胞侵襲的發(fā)生，與遷移的結(jié)果一致，抑制效果表現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度菌毒清提取物對各組CNE-1和CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響

圖2 不同濃度菌毒清提取處理后對各組CNE-1、CNE-2細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，×40)

2.4菌毒清提取物對各組細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細(xì)胞處理24 h后，通過細(xì)胞流式技術(shù)對各組細(xì)胞的凋亡情況見圖3。各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度的菌毒清提取物處理后，均促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。與對照組相比，除1.0 mg/ml 處理CNE-2組外，不同濃度的菌毒清提取物對各組細(xì)胞凋亡率的影響均顯著性高于對照組(P<0.05)。見表3。

圖3 不同濃度菌毒清提取物處理后各組CNE-1、CNE-2細(xì)胞的凋亡情況

2.5菌毒清提取物對各組細(xì)胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細(xì)胞處理24 h后，通過蛋白免疫印跡技術(shù)對各組細(xì)胞的Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白相對表達(dá)量。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物都能使Bcl-xl、Mcl-1表達(dá)量顯著下降，Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9表達(dá)量顯著性升高，且其效果具有劑量依賴性(均P<0.05)。見表4、圖4。

表4 不同濃度菌毒清提取物對CNE-1、 CNE-2細(xì)胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

1～4：對照組，1.0 mg/ml組，2.0 mg/ml組，3.0 mg/ml組圖4 各組CNE-1、CNE-2細(xì)胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(dá)

2.6菌毒清提取物對各組細(xì)胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比，除處理CNE-1的1.0 mg/ml 組Bcl-xl外，一定濃度的菌毒清提取物均能使Bcl-xl、Mcl-1 mRNA相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；除處理CNE-1的1.0 、2.0 mg/ml組Caspase-9及CNE-2的1.0 mg/ml組Caspase-9外，其余處理組均顯著性促進(jìn)了Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)，其效果具有一定的劑量依賴性。見表5。

表5 不同濃度菌毒清提取物對CNE-1、CNE-2細(xì)胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

鼻咽癌發(fā)病率占頭頸外科腫瘤首位〔11〕。目前，鼻咽癌患者一般采用放療或化療作為主要的療法，也能取得較好的治療效果，但發(fā)生抗拒和化療耐藥及其副作用往往會導(dǎo)致治療的失敗。據(jù)文獻(xiàn)報道，傳統(tǒng)中藥具有增加化療療效、降低放療化療毒副作用的功效，近幾年國內(nèi)外學(xué)者試圖尋找天然藥物或其活性成分用于鼻咽癌的治療〔12,13〕。菌毒清顆粒應(yīng)用已久，得到了廣大醫(yī)生及患者的認(rèn)可。本研究結(jié)果表明，菌毒清提取物對鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞的抑制作用呈濃度和時間依賴性。菌毒清提取物對鼻咽癌具有一定的抗腫瘤作用。并通過進(jìn)一步分析表明，該藥具有誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用。Mcl-1與Bcl-xl同屬于抗凋亡Bcl-2蛋白家族的一員，在內(nèi)源性凋亡途徑中，Mcl-1可以作為上游的分子通過阻止cytochrome c的釋放從而抑制細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生〔14～16〕， Bcl-xl通過阻斷Bax對線粒體外膜的破壞發(fā)揮抗凋亡作用〔17,18〕。通過Western印跡、熒光定量PCR法檢測表明，不同劑量的菌毒清提取物處理均降低了Mcl-1與Bcl-xl蛋白及mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)了凋亡。Caspase是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用〔19～21〕。經(jīng)不同劑量的菌毒清提取物處理后Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平都明顯升高，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上，菌毒清提取物能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2的活力、遷移和侵襲，并促進(jìn)了凋亡；其促進(jìn)凋亡的作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑相關(guān)〔22～24〕。