王琪 廖振蓉 羅德平 余瑛 李榮 (贛州市腫瘤醫(yī)院，江西 贛州 341000)

卵巢癌是發(fā)生在女性生殖器官的一種常見惡性腫瘤〔1〕，具有極高的死亡率，對女性生命具有極大的威脅〔2〕，病癥發(fā)生在盆腔深處，較為隱匿，且體積較小，無典型癥狀，因而早期較難發(fā)現(xiàn)〔3〕。而泛素化作為一種翻譯后可進行特異性修飾的過程〔4〕，對細胞的多種進程都具有調(diào)控作用，比如細胞的增殖、凋亡、周期等〔5〕。三方基序蛋白(TRIM)蛋白家族擁有進化保守的結(jié)構(gòu)域〔6〕，被定義為細胞生物學(xué)中的一種關(guān)鍵調(diào)控子〔7〕，其對細胞的增殖、凋亡、免疫、遷移等生物學(xué)功能都具有一定的調(diào)節(jié)功能〔8〕。目前已有研究顯示TRIM3、TRIM16、TRIM21等在實體瘤中的功能〔9〕，但TRIM19對腫瘤的作用還未有報道，本研究就其對卵巢癌細胞的影響進行探究。

1 材料與方法

1.1實驗材料 卵巢癌細胞系 SKOV3(中國科學(xué)院細胞庫，hce-0155)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、雙抗(含100 U/ml青霉素及鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，MTT檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物)，Transwell小室(北京萌壯科技有限公司)，pmirGLO載體(北京華越洋生物)，轉(zhuǎn)染試劑：LipofectamineTM2000(北京科展生物科技有限公司)，胰島素樣生長因子-2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP)3質(zhì)粒(上海羽朵生物，BAS6784)，TRIM19質(zhì)粒(山東維真生物，CH849963)。

1.2細胞培養(yǎng) 將細胞系SKOV3在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件控制為37℃、5%CO2，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d間隔更換1次培養(yǎng)液，3～5 d時使用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，當(dāng)細胞培養(yǎng)至3～5代且處于對數(shù)生長期時進行收集以繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 將卵巢癌SKOV3細胞分為對照組、過表達TRIM19組(轉(zhuǎn)染 TRIM19)、敲減TRIM19 組(轉(zhuǎn)染TRIM19-inhibitor)，另對TRIM19與IGF2BP3進行共轉(zhuǎn)染。當(dāng)細胞生長至融合度為70%～80%時，將其接種到細胞瓶中，按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即可用于后續(xù)實驗。

1.4Western印跡檢測IGF2BP3的表達 十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)收集轉(zhuǎn)染后SKOV3細胞中的總蛋白，通過BCA 法對蛋白總量進行測定，聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行2 h的轉(zhuǎn)膜，加入5%的脫脂奶粉密封1 h，后加入一抗(稀釋比例均1∶1 000)，4℃下孵育過夜。TBST洗滌，去除非結(jié)合抗體，然后添加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，室溫下孵育2 h。洗滌后加入顯色劑進行顯影。最后用凝膠成像軟件分析，得出表達結(jié)果。

1.5免疫共沉淀檢測泛素化情況 將卵巢癌SKOV3細胞分為A組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19和MYC-IGF2BP3)、B組(轉(zhuǎn)染空載體)、C組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19)、D組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19)、E組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19和HA-UB)、F組(轉(zhuǎn)染HA-UB)、G組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19)、H組(轉(zhuǎn)染HIS-TRIM19和HA-UB)、I組(轉(zhuǎn)染HA-UB),當(dāng)細胞生長至融合度為70%～80% 時，將其接種到細胞瓶中，按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。將含目的基因的質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合靜止約20 min后，緩緩滴入SKOV3細胞。通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即可用于后續(xù)實驗。按比例加入抗體(1∶200)孵育，加入蛋白A/G瓊脂糖珠進行孵育，洗滌。進行蛋白質(zhì)變性后，在3 000 r/min，4℃的條件下進行離心。轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入適量一抗，于振蕩器上緩緩振蕩過夜，免疫共沉淀孵育后，用HA抗體去免疫沉淀，進行SDS-PAGE，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，從而得出結(jié)果。

1.6噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞的增殖情況 將轉(zhuǎn)染的各組SKOV3細胞接種到96孔板上，每孔100 μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)結(jié)束之前的4 h加入20 μl MTT溶液(5 g/L)貼壁后進行收集，時間點分別是0 h、24 h、48 h、72 h，最終通過酶標(biāo)儀來檢測其A490值。

1.7Transwell檢測SKOV3細胞的遷移情況 使用培養(yǎng)基對各組細胞進行重懸，調(diào)整密度至2×105個/ml，接種至Transwell小室的上室，在下室加入培養(yǎng)基，后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)后將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，擦凈上室表面，90%無水乙醇中固定后使用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察計數(shù)細胞個數(shù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1過表達 TRIM19 對卵巢癌細胞增殖的影響 與對照組及敲減TRIM19組相比，過表達 TRIM19組48、72 h的細胞活力顯著下降(P<0.05)，與對照組相比，敲減TRIM19 組的細胞活力顯著上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組卵巢癌細胞不同時間的細胞活力

2.2過表達TRIM19對卵巢癌細胞遷移的影響 與對照組〔(156.42±18.43)個〕及敲減TRIM19組〔(211.57±19.24)個〕相比，過表達TRIM19組細胞的遷移能力顯著下降〔(97.68±16.51)個，P<0.05〕，敲減TRIM19組與對照組相比遷移能力顯著上升(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組卵巢癌細胞的遷移情況(結(jié)晶紫染色，×200)

2.3TRIM19對IGF2BP3表達量的影響 如圖2所示，與對照組(0.82±0.05)相比，過表達TRIM19組內(nèi)源IGF2BP3的表達量顯著減少(0.51±0.03，P<0.05)，敲減TRIM19組內(nèi)源IGF2BP3的表達量顯著上升(1.09±0.06，P<0.05)。

圖2 各組細胞IGF2BP3的表達

2.4TRIM19與IGF2BP3之間的相互作用 如圖3所示，在僅轉(zhuǎn)染TRIM19及空載體中無法檢測到TRIM19的存在，而當(dāng)HIS標(biāo)記的TRIM19(HIS-TRIM19)與MYC標(biāo)記的IGF2BP3(MYC-IGF2BP3)共轉(zhuǎn)染時可以檢測到HIS-TRIM19的存在，提示TRIM19與IGF2BP3之間存在一定的相互作用。

圖3 TRIM19與IGF2BP3之間的相互作用

2.5過表達 TRIM19 對IGF2BP3 泛素化程度的影響 如圖4所示，過表達TRIM19后會使免疫沉淀后的IGF2BP3多聚泛素化鏈有所增加，表明過表達TRIM19可增加IGF2BP3的泛素化程度。

圖4 過表達 TRIM19 對IGF2BP3 泛素化程度的影響

3 討 論

卵巢癌具有早期癥狀隱匿、侵襲能力強、惡性程度高等特點〔10，11〕，其發(fā)生與內(nèi)分泌紊亂、精神壓力大、年齡等因素具有緊密的聯(lián)系〔12〕。而其增殖轉(zhuǎn)移對患者的臨床療效、預(yù)后等都具有較大的影響〔13〕，因而對其增殖及遷移的影響因素進行研究就極為必要。

泛素化過程中，泛素分子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在癌細胞中會有所改變〔14〕。部分腫瘤抑制因子及癌基因同泛素-蛋白酶體途徑之間具有相互作用，并在泛素綴合及解耦聯(lián)之間起到一定作用，與腫瘤的發(fā)生進展具有一定的聯(lián)系〔15〕。TRIM19又稱為PML，是TRIM家族的成員之一，幾乎在所有可被檢測到的細胞系中都有所表達，定位于細胞核中〔16〕，有研究證明，其含有視黃酸受體(RAR)α，對于細胞防御具有一定的參與作用〔17〕。IGF2BP3又稱為IMP3，是一種可以對胰島素生長因子2及癌胚RNA進行調(diào)控的結(jié)合蛋白，在肺癌、乳腺癌、腎癌中呈高表達狀態(tài)，而在正常組織呈現(xiàn)低表達的狀態(tài)〔18，19〕。如王瑾等〔20〕在了解相關(guān)蛇鱗狀細胞癌及miR-299-3p的研究進展基礎(chǔ)上，對此細胞癌發(fā)展的相關(guān)機制進行研究，最終得出miR-299-3p對TRIM27具有靶向下調(diào)的作用，對蛇鱗狀細胞癌的遷移、增殖及侵襲具有一定的抑制作用。除此之外TRIM3、TRIM16、TRIM21等與癌癥進展的相關(guān)性均有所研究。

本研究結(jié)果提示，TRIM19與IGF2BP3之間具有相互作用，TRIM19會對IGF2BP3進行泛素化修飾；過表達TRIM19會增加IGF2BP3的泛素化程度。蛋白質(zhì)泛素化是真核生物調(diào)控各個生物過程的翻譯后修飾過程，并且相關(guān)研究表明這種過程也會對癌基因蛋白產(chǎn)物及腫瘤抑制蛋白進行調(diào)節(jié)〔21〕。本研究結(jié)果提示，過表達TRIM19可能可以抑制卵巢癌細胞的增殖能力；過表達TRIM19可能可以抑制卵巢癌細胞的遷移能力。

綜上，TRIM19可增加IGF2BP3的泛素化程度，從而抑制卵巢癌細胞的增殖及遷移。但由于研究規(guī)模及時間的限制，其表達模式未進行探索，仍需擴大研究規(guī)模進一步探索。