魏征 張俊萍

(1河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3河南中醫(yī)藥大學(xué))

肺癌是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的癌癥，在癌癥死亡人數(shù)統(tǒng)計中占比24%，最新數(shù)據(jù)表明其5年生存率只有19%〔1〕。2019年中國腫瘤的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國肺癌新發(fā)病例78.1萬例，死亡病例為62.6萬，占癌癥死亡人數(shù)的27.2%〔2〕。手術(shù)、放療、化療是治療肺癌的主要方法，50%以上肺癌患者確診時已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，放化療便成為晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的主要治療手段。近年來，靶向藥物的出現(xiàn)給NSCLC帶來新的希望，但療效有限〔3〕。因此，近年來肺癌的治療更強(qiáng)調(diào)綜合治療，而中醫(yī)藥因其在臨床治療中的獨(dú)到作用引起了醫(yī)學(xué)界的矚目。大量研究表明，中醫(yī)藥在肺癌術(shù)后改善患者生存質(zhì)量、降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、延長生存期和調(diào)節(jié)免疫功能等方面均具有一定的優(yōu)勢〔4〕。

中醫(yī)辨證論治的最基本原則是“治病必求于本”，并針對病因進(jìn)行治療，肺癌是以“瘀毒”為基本病機(jī)〔5〕，以此為依據(jù)確立了活血化瘀，解毒攻毒為中晚期肺癌的重要治法〔6〕。化瘀解毒方是我們醫(yī)院常用方，化瘀解毒方所含中藥均證實了臨床治療癥瘕痞塊積證，方中用搜剔破瘀之力較強(qiáng)的蟲類藥，以達(dá)到破瘀血、消積塊的目的。前期實驗也已經(jīng)證明，化瘀解毒方能有效抑制胃癌、肺癌等多種細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔7，8〕，同時動物實驗也給出了相同的實驗結(jié)果〔9〕。通過促凋亡是殺死腫瘤細(xì)胞的主要途徑之一，化瘀解毒方的含藥血清(HJRMS)能否具有促肺癌凋亡的作用，其機(jī)制是什么尚不清楚。因此，探明HJRMS對于肺癌細(xì)胞的凋亡作用及其中的分子機(jī)制，對于尋找和開發(fā)新的抗腫瘤中藥意義重大。本實驗對HJRMS在肺癌細(xì)胞凋亡過程中的作用和作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 為了保證試驗藥效的一致性，藥物來源使用配方顆粒劑，確保指紋圖譜的一致性?；鼋舛痉脚湮闉槿? g，天龍3 g，三七粉3 g，半枝蓮15 g，廣木香3 g。將配方顆粒劑全蝎、天龍、三七粉、半枝蓮和廣木香(廣東一方制藥有限公司購買)換算成等效生藥量進(jìn)行配伍。

1.1.2細(xì)胞和試劑 人肺癌細(xì)胞株A549 ( 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自上海碧云天公司；MTT粉劑購自Sigma-Aldrich；Bcl-2、Bad和Caspase-3單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology 公司；β-actin和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自Invitrogen公司；Annexin V-FITC試劑盒購自美天旎公司。

1.1.3儀器設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀(美國 PE 公司)；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；小型垂直電泳槽和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)成像分析儀(美國 Bio-Rad公司)；多通道流式細(xì)胞儀(美國 BD公司)；實時熒光定量PCR儀(瑞士 Roch公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞系購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。肺癌細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱設(shè)置CO2含量為5%，溫度為 37℃。正常培養(yǎng)及傳代，細(xì)胞長滿80%時進(jìn)行實驗。

1.3含藥血清的制備 取SPF級大耳白兔9 只，實驗前禁食12 h，根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算出大耳兔的灌胃劑量，取6只給予化瘀解毒方藥30 g/(d·kg)劑量灌胃。對照組3只給予相同劑量的生理鹽水，1次/d，連灌1 w。于末次用藥后1 h，無菌條件下心臟采血，分離血清(其中包括含藥血清和對應(yīng)的對照血清)，56℃、30 min下補(bǔ)體滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細(xì)胞活力檢測實驗 人肺癌A549 細(xì)胞，重懸成單細(xì)胞懸液濃度為3×104個/ml，均勻地接種于96 孔培養(yǎng)板中使每孔細(xì)胞數(shù)在3 000個左右。孵育過夜，用含有不同濃度HJRMS的培養(yǎng)基(1%，2%，4%，8%，16%，32%)處理，其余孔加含有對照組血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)分別孵育24，48 h。然后，向每個孔中添加20 μl 5%的MTT，并在37℃下孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μl。全自動酶標(biāo)儀中速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。490 nm波長，測定每孔的吸光度(A)值。計算細(xì)胞生長抑制率公式：抑制率=(1-藥物組A/空白對照組A)×100%。并計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)，確定低劑量組(含2%HJRMS)、中劑量組(含4%HJRMS)、高劑量組(含8%HJRMS)和對照組(含8%對照組無藥血清)用于后期研究(低劑量組和中劑量組分別補(bǔ)充不含藥血清6%和4%使最終每組的血清總含量一致，下同)。

1.5流式細(xì)胞技術(shù) Annexin V-FITC試劑盒用于檢測凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合的Annexin V-FITC對凋亡細(xì)胞呈陽性染色，而碘化丙啶(PI)呈陰性染色。分別處理24 h后，將細(xì)胞重新懸浮在100 μl 1×結(jié)合緩沖液中，數(shù)量為106細(xì)胞。然后，將10 μl Annexin V-FITC添加到含有106細(xì)胞的每根試管中，并將混合物在室溫下在黑暗中再培養(yǎng)15 min。然后在使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析之前立即將PI添加到混合物中，樣品上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.6Western印跡檢測 正常培養(yǎng)細(xì)胞，后將A549肺癌細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)皿中，分別提取每組處理過的細(xì)胞總蛋白質(zhì)，然后用SDS-PAGE在120 V的恒定電壓下分離90 min。然后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，分別用抗體(Bcl-2、Bad、Caspase-3和β-actin)進(jìn)行敷育后，用對應(yīng)的二抗進(jìn)行敷育，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測蛋白質(zhì)條帶。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 正常培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，消化細(xì)胞均勻地接種于6孔板中，孵育12 h后。繼續(xù)孵育24 h，提取總RNA。Bcl-2、Bad和β-actin 引物由上海生工合成，Bcl-2：正義鏈5′- TTGCCAGCCGGAACCTATG-3′，反義鏈5′- CGAAGGCGACCAGCAATGATA-3′，擴(kuò)增長度為88 bp。Bad：正義鏈5′- CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3′，反義鏈5′- CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′，擴(kuò)增長度為249 bp。β-actin：正義鏈5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反義鏈5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT-3′，擴(kuò)增長度為250 bp。Bcl-2的反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴(kuò)增溫度 95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s進(jìn)行40 個循環(huán)。Bad的反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴(kuò)增溫度95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s進(jìn)行40 個循環(huán)。β-actin的反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴(kuò)增溫度 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s進(jìn)行40個循環(huán)。最終用獲得的CT值并計算2-ΔΔCt值進(jìn)行計算分析。用重復(fù)測量的每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即平均 Ct 值，用于目標(biāo)基因表達(dá)的檢測，以2-ΔΔCt表示 mRNA 的相對表達(dá)量。目標(biāo)基因△Ct=目標(biāo)基因 Ct 值-同一樣本內(nèi)參基因 Ct 值。目標(biāo)基因的相對循環(huán)數(shù)(△△Ct 值)=處理組的目標(biāo)基因△Ct 平均值-對照組的目標(biāo)基因△Ct 平均值。對照組表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為 1，取 3次實驗均數(shù)并繪制相對 mRNA 表達(dá)量圖。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HJRMS對肺癌A549細(xì)胞增殖活力的影響 對照組的A549細(xì)胞生長狀態(tài)良好；與對照組相比較，HJRMS組A549細(xì)胞的增殖明顯降低了，隨著HJRMS濃度的增加，A549細(xì)胞增殖被抑制的現(xiàn)象越明顯，并呈一定的濃度依賴性。見表1。說明HJRMS對于肺癌A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，計算出HJRMS對A549細(xì)胞的24 h的IC50=15.73。

表1 HJRMS對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.2HJRMS對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 HJRMS可以明顯促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡，無論是早期凋亡還是晚期凋亡。隨著濃度增高，凋亡的細(xì)胞數(shù)也隨之增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3HJRMS對肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HJRMS作用于肺癌A549 細(xì)胞后，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白Bad和Caspase-3表達(dá)顯著增高，與對照組

比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 HJRMS對肺癌A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.4HJRMS對肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA的影響 與對照組比較，低、中、高劑量組肺癌細(xì)胞中Bad mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 HJRMS對肺癌A549細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響和HJRMS作用于A549 肺癌細(xì)胞24 h后、Bcl-2和Bad的蛋白和mRNA表達(dá)水平

3 討 論

一種理想的抗癌藥物應(yīng)該能夠引起癌細(xì)胞的程序性死亡，從而不傷及正常細(xì)胞。近年來，中醫(yī)藥已成為抗腫瘤藥物研究的熱點和候選物質(zhì)的來源。本研究發(fā)現(xiàn)，HJRMS對A549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。此外，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果還提示HJRMS可增加A549細(xì)胞的凋亡，無論是早期還是晚期凋亡。也就是說，HJRMS可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞數(shù)量的增加。本文結(jié)果表明，HJRMS明顯抑制細(xì)胞增殖活力。HJRMS能顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。隨著HJRMS濃度的增加凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。這些定量分析結(jié)果表明，HJRMS的抗腫瘤作用主要是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖來實現(xiàn)的。線粒體途徑的凋亡指標(biāo)，線粒體膜電位的變化主要受Bcl-2家族蛋白的調(diào)控〔10～12〕。Bcl-2家族包括抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2和Bad、Caspase-3等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白〔13〕。Bcl-2水平的降低導(dǎo)致線粒體膜通透性和細(xì)胞色素c釋放的改變，從而允許凋亡復(fù)合物的形成并激活Caspase家族的蛋白質(zhì)〔14〕。Caspase-3的激活觸發(fā)了細(xì)胞凋亡的最終過程〔15〕。Western印跡分析顯示HJRMS可以抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bad和Caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究提示，HJRMS通過調(diào)控Bcl-2和Bad的mRNA表達(dá)水平，直接影響相應(yīng)蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)共同表明HJRMS可能是通過影響B(tài)cl-2和Bad的mRNA水平，影響了Bcl-2和Bad蛋白的表達(dá)，激活了線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)了Caspase-3的激活，從而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)論與MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果完全一致。

綜上，HJRMS通過降低Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bad和caspase-3的表達(dá)，在體外具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。HJRMS是一種具有明顯抗腫瘤作用的中藥復(fù)方血清，有望成為治療肺癌的一種潛在的抗腫瘤藥物。