蘇博 錢國武 閆振宇 張森 王晶璇

(南陽市中心醫(yī)院 1病理科，河南 南陽 473000；2普通外科)

原發(fā)性肝癌(PHC)屬于我國常見的惡性腫瘤，流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，中國肝癌粗發(fā)病率為25.9/10萬，是全球肝癌粗發(fā)病率的2倍〔1〕。由于PHC早期診斷率低、高侵襲性及放化療不敏感等多種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致其病死率較高，臨床預(yù)后差〔2〕。PHC的發(fā)生發(fā)展與腫瘤局部微環(huán)境有關(guān)〔3〕，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78屬于熱休克家族成員之一，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)〔4〕，參與了乳腺癌〔5〕、食管癌〔6〕等多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制，目前關(guān)于PHC組織中GRP78表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚，本研究通過采用免疫組化方法檢測(cè)PHC組織中GRP78的表達(dá)水平，探討其與臨床-病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月1日至2014年12月31日于南陽市中心醫(yī)院普外科和肝膽胰腺外科擇期行肝癌根治術(shù)的96例PHC患者(PHC組)和45例腹部外傷患者(對(duì)照組)。PHC組男50例，女46例，平均年齡(55.12±6.49)歲；對(duì)照組男25例，女20例，平均年齡(57.10±5.23)歲。兩組性別和年齡比較無顯著差異(P>0.05)。PHC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②腫瘤組織完整切除，即術(shù)后影像學(xué)證實(shí)無惡性組織殘留，手術(shù)切緣周圍均陰性，術(shù)后組織病理學(xué)證實(shí)為PHC；③術(shù)前和術(shù)后均未進(jìn)行放療、化療及生物制劑治療等；④臨床資料完整及配合隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心功能不全、腎功能不全、心臟病及其他惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重黃疸、腹腔積液、門靜脈主干栓塞、凝血功能障礙等。所有患者術(shù)后每3個(gè)月進(jìn)行復(fù)診1次，必要時(shí)進(jìn)行影像學(xué)檢查，生存期為手術(shù)后第1日計(jì)算，終止日期為患者死亡日期或末次隨訪日期，本研究中末次隨訪截止日期為2019年12月31日，總生存時(shí)間定義為手術(shù)后至死亡或最后隨訪時(shí)間。另選取3例PHC患者手術(shù)后新鮮癌組織和癌旁組織及3例腹部外傷行肝臟探查術(shù)患者的正常肝臟組織，對(duì)癌組織、癌旁組織及正常組織中GRP78蛋白的表達(dá)水平的差異進(jìn)行Western印跡檢驗(yàn)，3例PHC患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)同上述。所有研究對(duì)象知情同意且簽署知情同意協(xié)議書，本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(LCLL-20130516)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1試劑 兔源性GRP78單克隆抗體購買于萬類生物科技有限公司(沈陽，中國)。免疫組化(SP)染色試劑盒及二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG〕購買于上海碧云天生物試劑有限公司(上海，中國)。

1.2.2SP SP法進(jìn)行SP染色，取南陽市中心醫(yī)院病理科石蠟包埋的切片，連續(xù)切片后制成4 μm厚度切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟和水化，檸檬酸鈉緩沖液加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再次采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。10%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗后4℃孵育過夜，復(fù)溫后PBS洗滌3次，每次3 min，滴加二抗室溫孵育30 min。切片用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。切片沖洗干燥后中性樹膠封片。以已知陽性反應(yīng)片作為陽性對(duì)照，以PBS作為一抗用于陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果按照如下判定：GRP78抗原陽性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)和胞膜中出現(xiàn)黃色顆粒，與背景對(duì)比，無色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別得0、1、2、3分；陽性細(xì)胞數(shù)得分：隨機(jī)采集10個(gè)代表性的視野計(jì)算陽性表達(dá)率，陽性表達(dá)率為陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%，陽性表達(dá)率小于5%(-)、5%～25%(+)、26%～50%()及50%以上()分別得分0、1、2、3分。染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞數(shù)得分為0～1分、2～3分、4～5分和≥6分時(shí)分別計(jì)為陰性(-)、弱陽性(+)、中度陽性()和強(qiáng)陽性()，本研究中將“～”視為高表達(dá)，將“-～+”視為低表達(dá)。比較PHC組和對(duì)照組GRP78表達(dá)水平的差異。

1.2.3Western印跡實(shí)驗(yàn) 取癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織分別置于消毒后的研缽中，一邊加入液氮一邊研磨成粉末，收集所有粉末移入EP管，加入500 μl RIPA裂解液，冰上孵育約30 min后離心，吸管吸取上清液于-80℃冰箱中保存。取5 μl蛋白樣品進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)、牛奶封閉，加入一抗GRP78抗體(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)并4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。每個(gè)條帶的蛋白灰度值采用Image J軟件檢測(cè)。組織中GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)水平=GRP78灰度值/β-actin灰度值，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

1.2.4臨床資料收集 通過住院病歷系統(tǒng)收集96例患者性別、年齡、HBsAg、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤細(xì)胞分化程度、術(shù)前AFP水平、微血管侵犯、美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)分期等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)，方差分析，SNK-q檢驗(yàn)，Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析，Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié) 果

2.1GRP78在PHC患者癌組織中的表達(dá)和分布 PHC組GRP78高表達(dá)73例，低表達(dá)23例；對(duì)照組GRP78高表達(dá)9例，低表達(dá)36例。與對(duì)照組比較，PHC組GRP78高表達(dá)率顯著升高(χ2=39.542，P<0.001)。在PHC組中，GRP78蛋白陽性信號(hào)為黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)和胞膜中。見圖1。

圖1 PHC患者肝癌組織免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.2PHC患者癌組織中GRP78表達(dá)水平和臨床-病理特征的關(guān)系 PHC患者癌組織中GRP78表達(dá)水平與腫瘤直徑、腫瘤細(xì)胞分化程度、微血管侵犯和AJCC分期顯著相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 PHC患者癌組織中GRP78表達(dá)水平與臨床-病理特征的關(guān)系(n)

2.3PHC患者癌組織中GRP78蛋白的表達(dá)水平 PHC患者癌組織和癌旁組織及正常肝臟組織中GRP78蛋白表達(dá)水平分別為1.39±0.45、0.87±0.14和0.26±0.03，3組相比存在顯著差異(F=10.726，P=0.010)。與正常肝臟組織比較，PHC患者癌組織和癌旁組織中GRP78蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與癌旁組織相比，PHC患者癌組織中GRP78蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 PHC患者癌組織和癌旁組織及組正常肝臟組織中GRP78蛋白表達(dá)水平的比較

2.4Cox回歸分析 截止到隨訪時(shí)間，本研究中PHC患者死亡39例，生存57例。Cox回歸分析結(jié)果顯示，PHC患者5年生存狀態(tài)與腫瘤直徑、腫瘤細(xì)胞分化程度、微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表達(dá)水平有關(guān)(P<0.05)，其中微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表達(dá)水平是影響PHC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.001)，見表2。

表2 PHC患者生存的單因素和多因素分析

2.5PHC患者癌組織中GRP78的表達(dá)水平與5年生存率的關(guān)系 GRP78高表達(dá)組5年生存率顯著低于GRP78低表達(dá)組(Log-Rank=4.951，P=0.026)。見圖3。

圖3 PHC患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

2018年，肝癌發(fā)病率位于全球癌癥發(fā)病率第6位，死亡率位于第4位〔1〕，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后較差，故而深入探討PHC分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制對(duì)提高患者預(yù)后尤其重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白合成及分泌的重要場(chǎng)所之一，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白生理功能具有顯著的作用，機(jī)體肝細(xì)胞是含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量最多的體細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是指由于多種原因如炎癥、缺氧、鈣離子代謝紊亂等從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊、分泌、降解等生理功能的紊亂〔7，8〕，近年來研究認(rèn)為ERS在肝癌的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要作用〔9，10〕。GRP78屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，主要參與調(diào)控蛋白質(zhì)正常的生理功能，GRP78也被認(rèn)為屬于ESR的標(biāo)志蛋白之一，GRP78能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增長并抑制其凋亡，與腫瘤細(xì)胞的耐藥也密切相關(guān)〔11，12〕。

本課題組采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)PHC患者肝臟癌組織中GRP78表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步通過Western印跡法證實(shí)，GRP78蛋白在正常肝臟組織、PHC患者癌旁組織和PHC患者癌組織中表達(dá)同樣呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，而既往研究也均證實(shí)PHC患者肝癌組織中GRP78表達(dá)水平顯著升高〔13，14〕，這與本研究結(jié)果基本一致；另外，PHC患者腫瘤體積越大，腫瘤細(xì)胞分化程度越低、存在微血管侵犯及AJCC分期越高，GRP78表達(dá)水平相對(duì)升高，本研究提示GRP78可能與PHC的發(fā)生發(fā)展及局部侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Ying等〔14〕通過蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌患者術(shù)后1個(gè)月復(fù)發(fā)患者血清中GRP78自身抗體表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)患者，且GRP78自身抗體表達(dá)水平與臨床分期、門靜脈侵犯及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。在發(fā)病機(jī)制上，王月等〔11〕發(fā)現(xiàn)GRP78可以通過癌細(xì)胞表面的表皮生長因子受體結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤的局部侵襲和轉(zhuǎn)移，并降低肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性；此外，GRP78也可抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡過程〔12〕。Luo等〔15〕研究認(rèn)為，GRP78促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖可能與活化NF-κB信號(hào)通路及上調(diào)泛素樣蛋白FAT10表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果提示，PHC患者肝癌組織中GRP78表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)。

綜上，PHC患者肝癌組織中GRP78表達(dá)水平顯著上調(diào)，GRP78在PHC的發(fā)生和發(fā)展及腫瘤耐藥和免疫逃逸等多方面均起至關(guān)重要的作用，當(dāng)下調(diào)GRP78表達(dá)后可能會(huì)有效抑制腫瘤的生長，在未來靶向阻斷GRP78的表達(dá)也為肝癌的治療提供新的見解與思路〔16〕，但仍需更多的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。