高倩 王建宇 孟偉建 李靜 崔永健 魏琰 (衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 衡水 053000)

腦血管病危害身體健康，發(fā)病率、致殘、致死率及復(fù)發(fā)率均較高〔1〕。腦梗死是腦血管病的一種，隨著老齡人口占比的增加，老齡腦梗死的發(fā)病率逐年上升〔2〕。人參皂苷Rg1是人參、三七、絞股藍(lán)等多種中藥的重要有效單體成分，其功能具有抗氧化、抗衰老及減輕神經(jīng)功能損傷，作為中藥復(fù)方要以已廣泛應(yīng)用與腦血管疾病中〔3〕。人參皂苷Rg1具有一定的神經(jīng)保護(hù)及抗凋亡作用，但其機(jī)制尚不明確〔4〕。軸突導(dǎo)向蛋白(Sema)4D可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞激活，破壞內(nèi)皮功能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，人參皂苷Rg1在腦梗死中的應(yīng)用及對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用尚不清晰〔5〕。本研究對(duì)老齡腦梗死模型大鼠應(yīng)用人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)梗死大鼠神經(jīng)功能及Sema4D/神經(jīng)叢蛋白B1抗體(Plexin B1)信號(hào)通路的作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取清潔、健康的成年雄性SD大鼠30只，體重222～260 g，平均體重(228.95±18.05)g，15～20月齡，均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK(冀)2013-1-003，所有大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)，喂食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及清潔飲用水。

1.2方法

1.2.1大鼠梗死模型的制備〔6〕30只大鼠隨機(jī)選取6只作為空白組，其余大鼠采用在顯微鏡下利用燒灼的方法制備大鼠梗死模型。將大鼠固定，用三溴乙醇腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，消毒，于頸部切1 cm口，分離肌肉組織，暴露并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合皮膚。取左側(cè)臥位，剪開(kāi)右側(cè)外眥與耳屏之間約0.5 cm皮膚，暴露顳肌，剪開(kāi)顳肌，暴露顱骨，鉆開(kāi)1 mm的小洞，確保腦組織不被損傷，燒灼大腦中動(dòng)脈皮層支主干。顯微鏡觀察，若燒灼位置未出現(xiàn)復(fù)流，則血管燒灼成功，縫合傷口。放置在低溫37℃下，大鼠醒后給予預(yù)先準(zhǔn)備的食物。腦梗死模型大鼠制備成功：大鼠因疼痛左側(cè)肢體回縮，但反應(yīng)遲鈍或消失，倒懸時(shí)左上肢屈曲；行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈。

1.2.2分組及干預(yù) 將造模成功的24只模型大鼠隨機(jī)分為模型組和高、中、低人參皂苷組，大鼠于造模成功后24 h進(jìn)行腹腔注射預(yù)先配置好的人參皂苷Rg1溶液(購(gòu)自吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室)及同體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射15 d。高、中、低劑量人參皂苷Rg1組：40、20、10 mg/kg人參皂苷，模型組、空白組：等量生理鹽水。

1.2.3測(cè)定腦梗死面積 距最后一次干預(yù)24 h后大鼠斷頭取腦，取出兩側(cè)大腦半球，放入冰箱20 min，制作2 mm腦組織切片。37℃避光的條件下，染色，多聚甲醛固定。梗死部分為灰白色，正常部分為亮紅色。對(duì)腦切片拍照、保存。分析腦組織缺血病灶，將腦梗死面積加和，計(jì)算全腦梗死面積。

1.2.4神經(jīng)功能評(píng)分 無(wú)神經(jīng)損傷為0分；不完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，無(wú)意識(shí)為4分。

1.2.5神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、Glu和Asp水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)NSE水平：提取標(biāo)本包被液，對(duì)NSE 0.1 ml進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)M(jìn)而加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中。加蓋4℃ 24 h保存。次日使用洗滌液進(jìn)行3次全方位洗滌，甩干；各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢標(biāo)本0.1 ml，同時(shí)增加陽(yáng)性和陰性對(duì)照，置于43℃溫箱60 min，移去液體。同上述法則洗滌3次，甩干；孔內(nèi)加稀釋神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min；各孔內(nèi)加2 mol的NGF 0.05 ml，終止反應(yīng)。ELISA試劑盒(上海聯(lián)祖生物科技有限公司，規(guī)格：48T/96T，型號(hào)：LZ-R6696)，試驗(yàn)操作嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。以高效液相色譜法學(xué)進(jìn)行谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(ASP)含量測(cè)定。

1.2.6病理學(xué)檢查 大鼠大腦腦組織切片，4%甲醛固定，脫水，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.2.7Sema4D、Plexin-B1檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)Sema4D、Plexin-B1。將腦組織12 000 r/min離心15 min,得到腦組織上清液，將得到標(biāo)本提取液取各組大鼠組織，根據(jù)總蛋白體取試劑盒提取血清蛋白質(zhì)濃度。行電泳分離蛋白。洗膜10 min，共3次，分別用Sema4D、Plexin-B1的Ⅰ抗按比例4℃孵育過(guò)夜，洗膜3次，加入大鼠抗兔孵育2 h，最后洗膜3×10 min，重復(fù)試驗(yàn)5次，進(jìn)行顯色，曝光，結(jié)果以目的條帶β-actin進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行齊性方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腦梗死面積及神經(jīng)功能評(píng)分 如表1所示，與空白組相比，模型組、中、低、高劑量人參皂苷Rg1組腦梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分水平顯著較高(P<0.05)。與模型組相比，中、低、高劑量人參皂苷Rg1組腦梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分水平顯著較低(P<0.05)。與高劑量人參皂苷Rg1組相比，中、低人參皂苷Rg1組腦梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分水平顯著較高(P<0.05)。與低劑量人參皂苷Rg1組相比，中劑量人參皂苷Rg1組腦梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分水平顯著較低(P<0.05)。

2.2人參皂苷Rg1對(duì)腦組織Glu、NSE、Asp含量的影響 如表1所示，與空白組相比，模型組、中、低、高劑量人參皂苷Rg1組GLU、NSE、ASP水平顯著較高(P<0.05)。與模型組相比，中、低、高劑量人參皂苷Rg1組GLU、NSE、ASP水平顯著較低；中、低劑量人參皂苷Rg1組與高劑量人參皂苷Rg1組相比，高劑量人參皂苷Rg1組GLU、NSE、ASP水平顯著較低(P<0.05)；中劑量人參皂苷Rg1組與低劑量人參皂苷Rg1組相比，中劑量人參皂苷Rg1組GLU、NSE、ASP水平顯著較高(P<0.05)。

2.3各組腦組織病理學(xué)觀察 如圖1所示，空白組腦功能正常，腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元胞體豐滿，毛細(xì)血管無(wú)擴(kuò)張充血，無(wú)明顯病理改變；模型組腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變，包括神經(jīng)元數(shù)量減少，胞質(zhì)固縮、空泡變性，胞質(zhì)著色不均、胞核深染等；低劑量人參皂苷Rg1組大鼠大部分神經(jīng)元失去正常結(jié)構(gòu)，變性神經(jīng)元有所減少；中劑量人參皂苷Rg1組小部分神經(jīng)元失去正常結(jié)構(gòu)，變性神經(jīng)元明顯減少；高劑量人參皂苷Rg1組正常神經(jīng)元增多，變性神經(jīng)元極少。

圖1 各組腦組織病理觀察(HE染色，×200)

2.4人參皂苷Rg1對(duì)大鼠Sema4D/Plexin B1信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 如表1、圖2所示，與空白組相比，模型組、中、低、高劑量人參皂苷Rg1組Sema4D、Plexin-B1顯著較高(P<0.05)；與模型組相比，中、低、高劑量人參皂苷Rg1組Sema4D、Plexin-B1顯著較低(P<0.05)；與高劑量人參皂苷Rg1組相比，中、低劑量人參皂苷Rg1組Sema4D、Plexin-B1顯著較高(P<0.05)；與中劑量人參皂苷Rg1組相比，低劑量人參皂苷Rg1組Sema4D、Plexin-B1顯著較高(P<0.05)。

表1 人參皂苷Rg1對(duì)大鼠腦梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織Glu、NSE、Asp含量及Sema4D/Plexin B1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

1～5：模型組，低劑量人參皂苷Rg1組，中劑量人參皂苷Rg1組，高劑量人參皂苷Rg1組，空白組圖2 各組Sema4D、Plexin-B1表達(dá)比較

3 討 論

人參歷史悠久，被視為是緊急關(guān)頭的救命良藥〔7〕。人參皂苷Rg1對(duì)于腦缺血損傷存在一定的治療效果，該藥不良反應(yīng)及毒性較小，且方便提取，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)治療方式〔8〕。另有研究顯示，人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)再生、神經(jīng)軸突可塑性具有一定的促進(jìn)作用〔9〕。

腦組織易于產(chǎn)生活性氧，可氧化活性氮和不飽和脂肪酸，神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)自由基的抗性較弱，對(duì)于腦內(nèi)環(huán)境的變化較為敏感〔12〕。對(duì)大鼠應(yīng)用人參皂苷Rg1，可減少缺血再灌注帶來(lái)的神經(jīng)功能損傷、消除腦組織水腫，提升神經(jīng)功能評(píng)分〔13〕。人參皂苷Rg1具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過(guò)改善一系列蛋白反應(yīng)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮保護(hù)腦神經(jīng)的作用〔14〕。而人參皂苷Rg1調(diào)控Sema4D/Plexin B1信號(hào)通路可顯著改善血腦屏障的通透性。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1?？筛纳拼笫笊窠?jīng)功能評(píng)分，減小梗死面積，且高劑量人參皂苷Rg1效果優(yōu)于中劑量、低劑量。

GLU為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，病理狀態(tài)下，過(guò)度激活GLU具有較強(qiáng)的神經(jīng)興奮性毒性，腦細(xì)胞外液異常升高GLU，可誘導(dǎo)鈣超載，激活自由基及信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損害〔15〕。NSE是神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，存在于腦神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，其水平異常升高，提示神經(jīng)元細(xì)胞受損，表示神經(jīng)損害較為嚴(yán)重及梗死面積較大，腦梗死時(shí)，神經(jīng)元壞死，破壞細(xì)胞膜的完整性〔16〕。GLU大量堆積，過(guò)度激活蛋白，并介導(dǎo)受體門(mén)控性離子通道開(kāi)放，使離子、水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致急性神經(jīng)元腫脹、壞死，并引起細(xì)胞內(nèi)離子超載〔17〕。本文結(jié)果說(shuō)明，人參皂苷Rg1可使神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷減小，腦損傷的程度減輕。

Semaphorins家族被報(bào)道在多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，Sema4D已被證實(shí)在血管及免疫系統(tǒng)中有著重要地位，作為一種免疫性腦信號(hào)蛋白，其免疫信號(hào)素可影響機(jī)體多種免疫功能及炎性因子的表達(dá)，通過(guò)敲除PlexinB1及阻斷Sema4D信號(hào)作用，降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔18，19〕。Sema4D與PlexinB1受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控血腦屏障通透性〔20〕。人參皂苷Rg1具有促進(jìn)腦梗死后腦組織血管新生的作用，抑制Sema4D/PlexinB1通路可縮小梗死體積，破壞血腦屏障通透性和內(nèi)皮緊密連接蛋白〔21〕。本研究顯示，經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，大鼠Sema4D、Plexin-B1表達(dá)較低，說(shuō)明人參皂苷Rg1可能通過(guò)介導(dǎo)Sema4D/Plexin-B1信號(hào)通路縮小梗死體積。