伍海艷 葉金花 黃晶 唐婷 余瑛

(1贛州市第三人民醫(yī)院，江西 贛州 341000；2贛南醫(yī)學(xué)院；3贛州市腫瘤醫(yī)院；4贛州市人民醫(yī)院)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率和死亡率居生殖道惡性腫瘤的第一位，嚴(yán)重威脅女性身體的健康〔1〕。由于早期癥狀不明顯、中晚期時(shí)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲。宮頸癌手術(shù)治療效果十分有限，目前化學(xué)藥物治療仍然是宮頸癌重要的治療手段之一〔2〕。5-氟尿嘧啶(FU)是一種胸苷酸合成酶抑制劑，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU脫氧核苷酸(5F-dUMP)，從而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧核苷酸(dUMP)甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏っ撗鹾塑账?dTMP)，影響腫瘤細(xì)胞DNA的合成〔3〕。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子(RGS)16是RGS蛋白質(zhì)家族成員之一，能夠通過(guò)GTP酶激活蛋白活性并負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白信號(hào)，參與增殖、分化、趨化等多種細(xì)胞過(guò)程〔4〕。在腫瘤中，RGS16能夠被p53誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡〔5〕。然而，RGS16基因在宮頸癌發(fā)病及進(jìn)展中的作用未知。本研究旨在通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證RGS16聯(lián)合5-FU對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用，探討RGS16聯(lián)合5-FU干預(yù)宮頸癌進(jìn)程的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 宮頸癌細(xì)胞株HeLa購(gòu)買于中科院；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素購(gòu)于Hyclone公司；分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒pCDH-RGS16合成于安徽通用生物科技有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)于Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；抗體RGS16(ab119424,1∶1 000,Abcam)、β-actin(ab115777,1∶1 500,Abcam)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 常規(guī)培養(yǎng)：以1×104/cm2的密度將293T細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，用含10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，24 h后，將2 μg質(zhì)粒pCDH-RGS16與4 μl脂質(zhì)體混合制備無(wú)血清轉(zhuǎn)染液100 μl，轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen說(shuō)明書。轉(zhuǎn)染4～6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，依據(jù)設(shè)定的時(shí)間開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：以293T細(xì)胞培養(yǎng)上清、5-FU單獨(dú)或聯(lián)合處理宮頸癌細(xì)胞HeLa，具體分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDH的培養(yǎng)上清)、RGS16組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDH-RGS16的培養(yǎng)上清)、5-FU 組、RGS16/5-FU組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDH-RGS16的培養(yǎng)上清+5-FU)。

1.3Western印跡檢測(cè) 以總蛋白抽提試劑盒提取經(jīng)293T細(xì)胞培養(yǎng)上清、5-FU單獨(dú)或聯(lián)合處理的HeLa細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取15 μg提取的蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過(guò)夜孵育、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，然后以電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測(cè)目的基因表達(dá)，掃描膠片后使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.4熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)(qPCR) 將培養(yǎng)的細(xì)胞以1 200 r/min離心5 min收集，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，然后參考RNA提取試劑盒(Beyotime,上海，中國(guó))說(shuō)明書抽提總RNA，以紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。以1微克總RNA為模板，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(Beyotime，上海，中國(guó))說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，然后取1 μl產(chǎn)物，以SYBRGREEN方法定量檢測(cè)目的基因。qPCR條件為：95℃,5 min；(95℃,15 s；60℃,15 s)×40個(gè)循環(huán)。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將HeLa細(xì)胞以2 000個(gè)/孔濃度接種于96孔板，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后每孔加入10%體積的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1～2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，參考對(duì)照組計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HeLa細(xì)胞以100 000個(gè)/孔濃度接種于6孔板，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，然后以PBS洗滌1次細(xì)胞，以膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞。即以100 μl染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl FITC試劑、10 μl PI試劑，在37℃避光孵育15 min。然后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡，參考對(duì)照組計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn) 將指數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于Chamber小室中(內(nèi)加300 μl 無(wú)血清配眼鏡)，然后將Chamber小室置于24孔板內(nèi)(內(nèi)加600 μl 含10%血清的培養(yǎng)基)，培養(yǎng)48 h后取出Chamber小室，以棉簽輕輕擦去小室上表面的細(xì)胞，然后以4%甲醛固定Chamber小室下表面的細(xì)胞15 min，以0.5%的結(jié)晶紫染色液染色15 min，以去離子水洗滌、風(fēng)干。然后在顯微鏡下觀察、記錄染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞遷移率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組293T細(xì)胞成功表達(dá)RGS16蛋白 在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDH的泳道中沒(méi)有RGS16條帶顯示，而在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的泳道中有特異性RGS16條帶出現(xiàn)。該數(shù)據(jù)表明重組的293T細(xì)胞可分泌表達(dá)RGS16蛋白。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)293T細(xì)胞培養(yǎng)上清中RGS16蛋白表達(dá)

2.2RGS16蛋白協(xié)同5-FU抑制HeLa細(xì)胞增殖 與對(duì)照組(1.00±0.45)相比，RGS16組、RGS16/5-FU組細(xì)胞增殖率明顯下降(0.75±0.030、0.41±0.018，P<0.05)。并且RGS16/5-FU組細(xì)胞增殖率較5-FU組(0.59±0.040)明顯降低(P<0.05)。5-FU單獨(dú)組的IC50約60 μmol/L，但是RGS16與5-FU聯(lián)合用藥后，IC50降低至18 μmol/L，降幅約70%。

2.3RGS16蛋白抑制HeLa細(xì)胞遷移 與對(duì)照組比較，RGS16組、RGS16/5-FU組細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)。見表1和圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移(結(jié)晶紫染色，×100)

2.4RGS16蛋白協(xié)同5-FU促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組比較，5-FU組、RGS16組、RGS16/5-FU組細(xì)胞凋亡率顯著提高(均P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 5-FU協(xié)同RGS16促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞凋亡

2.5RGS16蛋白協(xié)同5-FU促進(jìn)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路 RGS16組、5-FU組、RGS16/5-FU組中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax分子表達(dá)量較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)(均P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌細(xì)胞HeLa的相對(duì)遷移、凋亡率及RGS16蛋白調(diào)控的凋亡信號(hào)分子相對(duì)表達(dá)

3 討 論

RGS16是一種GTPase激活蛋白(GAP)，能夠增加G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)相關(guān)的G蛋白的a-亞基的GTPase活性。在正?；虬┘?xì)胞系中，RGS16參與負(fù)調(diào)控MAPK、蛋白激酶B/磷脂酰肌醇3激酶(Akt/PI3K)、RAS同源基因家族成員(Rho)A和C-X-C基序趨化因子配體(SDF)-1/C基序趨化因子受體(CXCR)4癌基因通路〔6～8〕。最近，有證據(jù)表明RGS16在癌癥信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。作為致癌基因，RGS16促進(jìn)了許多人類癌癥的惡性進(jìn)展過(guò)程(如增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲、化療耐受等)〔9〕。在乳腺癌中，過(guò)表達(dá)RGS16能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞(MCF)7的增殖和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)的Akt的磷酸化〔10〕；在大腸癌中，轉(zhuǎn)染外源性p53基因可以誘導(dǎo)人B淋巴瘤細(xì)胞(EB)-1細(xì)胞中RGS16的表達(dá)，抗腫瘤藥doxouribicn能通過(guò)激活RKO細(xì)胞內(nèi)源性p53而誘導(dǎo)RGS16的表達(dá)〔11〕；基因分析提示RGS16過(guò)表達(dá)與膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖、遷移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、免疫和炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)〔12〕；在胰腺癌中，胰腺癌細(xì)胞株中RGS16 mRNA表達(dá)降低，RGS16的過(guò)表達(dá)可以抑制BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞的遷移和侵襲〔13〕。

5-FU是化療的關(guān)鍵藥物，普遍應(yīng)用于腸癌、胃癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤的臨床治療，也是治療宮頸癌的關(guān)鍵藥物。但是由于5-FU半衰期較短、生物利用度低、治療窗窄等缺點(diǎn)，導(dǎo)致5-FU單一用藥療效不穩(wěn)定〔14〕。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，RGS16能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。RGS16聯(lián)合5-FU用藥對(duì)HeLa細(xì)胞增殖與凋亡誘導(dǎo)作用更加顯著，并且RGS16可進(jìn)一步激活Caspase-3介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。將繼續(xù)研究RGS16/5-FU的對(duì)宮頸癌的作用及分子機(jī)制，為以RGS16為基礎(chǔ)的基因治療聯(lián)合化療對(duì)宮頸癌臨床治療效果的改善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。RGS16聯(lián)合以5-FU為代表的化療藥物可能成為宮頸癌新的靶向治療手段。