王凡寅 張桐 祝天輝 彭艷陽(yáng) 彭玲 姜曉丹 賴(lài)銘瑩

(1深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院(深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院)眼科，廣東 深圳 518067；2暨南大學(xué)附屬深圳市眼科醫(yī)院)

白內(nèi)障作為老年疾病的一種，其發(fā)病機(jī)制尚不明確〔1〕。研究表明，白內(nèi)障疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)有著密切的聯(lián)系〔2〕。氧化應(yīng)激在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中具有重要的調(diào)節(jié)作用，能夠?qū)е戮铙w上皮細(xì)胞的凋亡〔3〕。晶狀體上皮細(xì)胞能夠維持晶狀體的透明度，因此在晶狀體中有著重要的作用〔4〕。而經(jīng)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞后，出現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及晶狀體渾濁的表現(xiàn)，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展中有著明顯作用〔5〕。隨著醫(yī)療科技的發(fā)展及對(duì)白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞的不斷研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制中占據(jù)重要作用，更是在人晶狀體上皮細(xì)胞中起到調(diào)節(jié)氧化損傷的作用〔6〕。研究已證實(shí)miR-34a-5p表達(dá)上調(diào)參與在老年性核性白內(nèi)障中〔7〕。本研究探討miR-34a-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 家兔36只，由深圳市南方科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，2～4月齡，體重1.5～2.6 kg，雌雄兼有，均無(wú)眼疾，經(jīng)檢查確認(rèn)健康。miR-34a-5p抑制物，miR-34a-5p陰性對(duì)照物(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素、鏈霉素溶液購(gòu)于(Hyclone公司)，H2O2購(gòu)于(Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(CSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(Invitrogen公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco公司)，722型光柵分光光度計(jì)(上海醫(yī)用儀器分析廠)，活性氧熒光探針(DCFH-DA)(Abcam公司)，B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2試劑盒、SIRT1試劑盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 36只家兔行空氣栓塞處死，將全部家兔雙眼球立即摘取，確保眼球無(wú)菌無(wú)損壞后，進(jìn)行晶狀體剝離，放在盛有培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中〔培養(yǎng)液為10 ml極限必需培養(yǎng)基(MEM)，含有10%胎牛血清、青霉素為100×103U/L、鏈霉素0.1 g/L，并加入100 μmol/L H2O2〕，在溫度37℃，濕度為95%濕度、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)24 h。將透明兔晶狀體挑選出，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)使用。建立H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型。

1.3miR-34a-5p轉(zhuǎn)染及分組 將透明兔晶狀體采用隨機(jī)數(shù)字表法分為H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組與下調(diào)miR-34a-5p組各9個(gè)晶狀體，將各組晶狀體在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞分為3組，其中H2O2組不進(jìn)行任何處理，上調(diào)miR-34a-5p組進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-34a-5p陰性對(duì)照物，下調(diào)miR-34a-5p組進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-34a-5p抑制物。進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后，對(duì)各組標(biāo)記待測(cè)。

1.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。將各組細(xì)胞加入96孔板中，分別于24、48、72 h后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀在498 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的OD值。

1.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 常溫環(huán)境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS進(jìn)行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)反應(yīng)液100 μl，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，加入100 μl檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，常溫環(huán)境中靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，之后使用DAPI進(jìn)行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進(jìn)行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，取每切片3視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率，計(jì)算平均值。

1.6SOD、CSH-Px、MDA水平檢測(cè) 使用722型光柵分光光度計(jì)比色對(duì)SOD、CSH-Px、MDA水平進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)液體積(ml)設(shè)定比例為500∶1同時(shí)行冰上超聲對(duì)細(xì)胞裂解，3 000 r/min，在4℃條件下，進(jìn)行10 min離心處理，取出上清，放置冰上檢測(cè)。在波長(zhǎng)550 nm測(cè)定SOD水平，波長(zhǎng)532 nm測(cè)定MDA水平，波長(zhǎng)412 nm測(cè)定CSH-Px水平。

1.7活性氧(ROS)水平檢測(cè) 通過(guò)DCFH-DA所激發(fā)的熒光對(duì)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，首先使用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)DCFH-DA進(jìn)行稀釋?zhuān)壤秊?∶1 000，將濃度稀釋10 μmol/L。將收集好的細(xì)胞放置在DCFH-DA溶液上，在37℃條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，以5 min進(jìn)行混勻1次。在無(wú)血清的培養(yǎng)基內(nèi)對(duì)細(xì)胞洗滌3次，對(duì)未入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA進(jìn)行清除。采用熒光酶標(biāo)儀對(duì)熒光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，后以熒光強(qiáng)度對(duì)ROS水平進(jìn)行計(jì)算。

1.8Bcl-2、SIRT1檢測(cè) 使用Western印跡對(duì)Bcl-2、SIRT1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)較良好無(wú)污染對(duì)數(shù)的細(xì)胞，且在生長(zhǎng)期，將原培養(yǎng)液去除，以適量的胰酶進(jìn)行消化后，放到15 ml無(wú)菌離心管內(nèi)，保持溫度為4℃，進(jìn)行1 000 r/min,5 min的離心處理，去除上清，在冰PBS 5 ml進(jìn)行3次洗滌，然后加1 ml的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行充分混懸，在微量離心管內(nèi)，保持溫度為4℃，800 r/min，離心5 min。將上清去除。放入預(yù)冷后的細(xì)胞裂解液，并加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)。對(duì)Eppendorf管進(jìn)行吹打處理，將其混勻，在冰上進(jìn)行30 min靜置，在此期間繼續(xù)吹打數(shù)次。后在4℃條件下，離心處理30 min，將上清輕輕取出，去除沉淀。提取出蛋白均使用二喹啉甲酸(BCA)對(duì)Bcl-2、沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1進(jìn)行測(cè)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組活性率、凋亡率比較 與H2O2組相比，上調(diào)miR-34a-5p組活性率低于H2O2組，凋亡率高于H2O2組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組相比，下調(diào)miR-34a-5p組活性率較高，凋亡率較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組MDA、ROS水平比較 與H2O2組相比，上調(diào)miR-34a-5p組MDA、ROS水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組相比，下調(diào)miR-34a-5p組MDA、ROS水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組SOD、CSH-Px水平比較 與H2O2組相比，上調(diào)miR-34a-5p組CSH-Px、SOD水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組相比，下調(diào)miR-34a-5p組CSH-Px、SOD水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組miR-34a-5p表達(dá)在兔源性晶狀體上皮細(xì)胞中活性率、凋亡率MDA、ROS、SOD、GSH-Px水平比較

2.4各組Bcl-2、SIRT1表達(dá)比較 與H2O2組相比，上調(diào)miR-34a-5p組Bcl-2表達(dá)較高，SIRT1表達(dá)較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組相比，下調(diào)miR-34a-5p組Bcl-2表達(dá)較低，SIRT1表達(dá)較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組miR-34a-5p表達(dá)在兔源性晶狀體上皮細(xì)胞中Bcl-2、SIRT1表達(dá)比較

1～3:H2O2組、上調(diào)miR-34a-5p組、下調(diào)miR-34a-5p組圖1 Western印跡檢測(cè)各組Bcl-2、SIRT1表達(dá)

3 討 論

白內(nèi)障是世界上第一致盲原因，有相關(guān)調(diào)查顯示，在全球致盲因素中，由白內(nèi)障造成的失明患者占50%左右〔8〕。在65歲以上的老年人中的群體，白內(nèi)障發(fā)病率較高。因此，通過(guò)探究白內(nèi)障發(fā)病的機(jī)制，尋找出經(jīng)濟(jì)有效的防治途徑除具有學(xué)術(shù)意義外，更具有廣泛的社會(huì)效益〔9〕。在晶狀體中晶狀體的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能在維持晶狀體透明性中有著關(guān)鍵作用。通過(guò)在培養(yǎng)液內(nèi)觀察晶狀體中發(fā)現(xiàn)，ROS自由基是導(dǎo)致晶狀體內(nèi)的水不溶性蛋白的增加，進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生〔10〕。相關(guān)研究認(rèn)為，H2O2是引起白內(nèi)障發(fā)生的主要氧化物〔11〕。microRNA作為內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，在近幾年被發(fā)現(xiàn)能夠在靶基因3′-UTR互補(bǔ)配對(duì)或者降低靶基因的翻譯及對(duì)靶基因介導(dǎo)達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。在細(xì)胞的發(fā)育、增殖及衰老、凋亡中均有microRNA通過(guò)定位多個(gè)mRNA進(jìn)行參與〔12〕。通過(guò)miR-34a-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的研究，達(dá)到尋找出治療白內(nèi)障的目的，具有重要意義及價(jià)值。

晶狀體上皮細(xì)胞在晶狀體前囊內(nèi)的表面緊密吸附，與晶狀體纖維連接較為疏松，但一直分化為晶狀體纖維。細(xì)胞凋亡被分為兩類(lèi)，一類(lèi)是細(xì)胞死亡受體途徑，另一類(lèi)是線粒體途徑。成熟的晶狀體上皮細(xì)胞相比較正常晶狀體上皮細(xì)胞，平均密度較低〔13〕。在過(guò)熟期白內(nèi)障中有56%重疊細(xì)胞，在正常時(shí)，白內(nèi)障重疊細(xì)胞只在晶狀體細(xì)胞分裂生發(fā)帶。相關(guān)研究顯示，白內(nèi)障晶狀體前囊中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)重疊細(xì)胞，可能由于觸發(fā)細(xì)胞增殖機(jī)制致使〔14〕。H2O2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，一直在研究白內(nèi)障中被認(rèn)為是經(jīng)典模型。由H2O2誘導(dǎo)后的晶狀體上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)氧化損傷，使其出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)miR-34a-5p下調(diào)，能夠提升晶狀體上皮細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞的凋亡。

在晶狀體上皮細(xì)胞中，由于各種刺激因子引起氧自由基是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的主要因素〔16〕。在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中，由于氧化應(yīng)激在其中具有重要作用。經(jīng)過(guò)外源性或內(nèi)源性的ROS對(duì)細(xì)胞信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的綜合作用作為氧化應(yīng)激損傷的主要表現(xiàn)〔17〕。當(dāng)ROS的過(guò)度表達(dá)，致使細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，進(jìn)而晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)衰老、凋亡及壞死的后果。當(dāng)H2O2誘導(dǎo)后的晶狀體上皮細(xì)胞后，ROS會(huì)出現(xiàn)明顯表達(dá)，能夠使正常晶狀體上皮細(xì)胞受到破壞，從而導(dǎo)致〔18〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)miR-34a-5p下調(diào)，能夠降低H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

當(dāng)晶狀體細(xì)胞膜上出現(xiàn)大量脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積，使其膜上相關(guān)酶活性降低，損害晶狀體屏障功能，導(dǎo)致晶狀體的光學(xué)性質(zhì)與晶狀體中環(huán)境出現(xiàn)變化，脂質(zhì)過(guò)氧化物同時(shí)能夠引起晶狀體出現(xiàn)混濁〔19〕。氧化應(yīng)激在白內(nèi)障的發(fā)病中有著重要作用，是關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子，能夠?qū)е戮铙w上皮細(xì)胞的凋亡〔20〕。經(jīng)過(guò)H2O2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞增加ROS含量，從而使細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)降低，如SOD、CSH-Px等，在白內(nèi)障的形成中占據(jù)重要作用〔21〕。SOD作為在正常機(jī)體中存在的抗氧化酶，能有效地清除自由，抵抗機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷及維持正常的代謝白內(nèi)障形成〔22〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)miR-34a-5p下調(diào)，能夠抵抗H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激，說(shuō)明miR-34a-5p在H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞中的作用機(jī)制。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因，能夠抑制超氧離子產(chǎn)生過(guò)多的程序化死亡誘導(dǎo)因子釋放，以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的〔23〕。SIRT1作為哺乳動(dòng)物內(nèi)重要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)具有依賴(lài)性的乙?；?，在多種細(xì)胞的衰老、凋亡等生理過(guò)程中均有參與〔24〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)miR-34a-5p下調(diào)，能夠抵抗H2O2誘導(dǎo)兔源性晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡、衰老等情況。

綜上，當(dāng)H2O2誘導(dǎo)后的晶狀體上皮細(xì)胞中下調(diào)miR-34a-5p表達(dá)能夠提升細(xì)胞的活性，抵抗細(xì)胞凋亡，能夠顯著改善氧化應(yīng)激，同時(shí)減輕氧化應(yīng)激造成的損傷，并具有抗衰老的作用。