劉彤 馮超 顧毅 宋哲

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院血管甲狀腺外科，四川 成都 610072)

甲狀腺癌是一種源于甲狀腺濾泡上皮或濾泡旁上皮細胞頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來此病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢〔1〕。甲狀腺癌的發(fā)病機制受到集體基因及周邊環(huán)境影響，臨床所知的因素有肥胖、基因遺傳、社會習(xí)俗、電離輻射暴露及變現(xiàn)遺傳學(xué)的變異等〔2〕。miRNA是一組非編碼的小RNA，在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，已有研究證實，miRNA在胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中表達異常，提示其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)，分析其可能具有抑癌或促癌的作用〔3〕。更有學(xué)者表示〔4〕，miR-191在非小細胞肺癌患者體內(nèi)呈高表達，且與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲-遷移及細胞周期密切相關(guān)。本文主要探究基于人跨膜受體蛋白(Notch)-1信號通路上調(diào)miR-191對甲狀腺癌細胞的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究細胞：甲狀腺癌8505C細胞株購于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。本研究經(jīng)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會批準。主要試劑：miR-191抑制劑(inhibitor)、miR-191模擬物(mimics)由百奧邁科上海傳秋生物科技有限公司生物技術(shù)有限公司合成；10%胎牛血清購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；MTT試劑盒購于北京雅安達生物技術(shù)有限公司；Notch-1抗體購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司；Split多毛增強子(HES)5抗體購于武漢華美生物工程有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2抗體購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將甲狀腺癌8505C細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，放置于5% CO237℃恒溫箱中培養(yǎng)，濕度保持在90%左右，待細胞融合達到90%時，使用胰蛋白酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的細胞按5×105個/孔，接于6孔板中，生長至75%轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)好的細胞分成3組，每組8孔，空白組不進行處理，其余兩組分別按照miR-191 inhibitor轉(zhuǎn)染試劑(下調(diào)組)及miR-191 mimics轉(zhuǎn)染試劑(上調(diào)組)說明書進行轉(zhuǎn)染操作。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染鑒定 使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對miR-191轉(zhuǎn)染情況進行評定，實驗步驟：將1 ml TRNzol加入甲狀腺癌8505C細胞混勻后提取總DNA，并檢測其純度和濃度，提取2 μg總DNA并加入內(nèi)參GAPDH及目的小分子RNA miR-191逆轉(zhuǎn)錄引物，42℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR條件：40個循環(huán)，在95℃中變性10 s，于60℃退火10 s，72℃條件下延伸15 s。使用Primer5.0軟件對引物序列進行設(shè)計，miR-191引物序列上游：5′-ACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAAA AGC-3′，下游：5′-CTCAACTGG TGTCGTGGA-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，下游：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.4細胞增殖、凋亡能力評價 使用MTT比色法檢測細胞增殖情況，于波長為570 mm處測定細胞OD值，細胞增殖率=(細胞組OD值/參照組OD值)×100%。采用TUNEL法檢測細胞凋亡能力，細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5細胞遷移、侵襲能力評價 利用細胞劃痕實驗檢測其遷移能力，使用光學(xué)顯微鏡仔細觀察其遷移能力，并記錄其變化。利用Transwell穿膜實驗對細胞的侵襲能力進行評價，首先對細胞進行胰酶消化1次或2次，利用重懸細胞密度進行調(diào)整，加入150 μl細胞懸液進行培養(yǎng)，最后用乙醇將其固定5 min，將溶液進行染色，使用光學(xué)顯微鏡仔細觀察其侵襲過程，并拍照記錄。

1.2.6Notch-1信號通路蛋白表達量評價 使用Western印跡檢測，提取50 μg蛋白后煮沸，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜、封閉，室內(nèi)保存1.5 h后添加一抗(1∶2 000)孵育，1 d后取出、Western液清洗，添加二抗(1∶5 000)后孵育1 h，Western液清洗后進行顯色、曝光、成像，ImageJ圖像分析系統(tǒng)檢測條帶灰度值，檢測Notch-1信號通路蛋白表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞miR-191表達量比較 與空白組(1.05±0.34)相比，上調(diào)組miR-191表達量(1.87±0.59)顯著上調(diào)，下調(diào)組miR-191表達量(0.64±0.31)顯著下降(P<0.05)；上調(diào)組miR-191表達量高于下調(diào)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.2各組細胞增殖、凋亡能力比較 如表1、圖1所示，與空白組相比，上調(diào)組各時期增殖率均較低，凋亡率均較高；下調(diào)組各時期細胞增殖率較高，凋亡率較低，3組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組各時期細胞增殖率較低，凋亡率較高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖、凋亡能力比較

圖1 各組細胞凋亡情況(DAPI染色，×400)

2.3各組細胞遷移、侵襲能力比較 如表1、圖2所示，與空白組相比，上調(diào)組細胞遷移、侵襲數(shù)量均較少，下調(diào)組細胞遷移、侵襲數(shù)量均較多，3組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組細胞遷移、侵襲數(shù)量均較少，兩組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.4Notch-1信號通路蛋白表達量比較 如圖3、表2所示，與空白組相比，上調(diào)組Notch-1、HES5、Bax表達量均較高，Bcl-2表達量較低，下調(diào)組Notch-1、HES5、Bax表達量均較低，Bcl-2表達量加高，3組間差異均具有顯著差異(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組Notch-1、HES5、Bax表達量均較高，Bcl-2表達量較低，兩組比較有顯著差異(P<0.05)。

圖3 各組細胞遷移(×400)侵襲能力(×300)比較(結(jié)晶紫染色)

圖3 各組細胞Notch-1信號通路Western印跡

表2 Notch-1信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的癌癥類型之一，可發(fā)生于任何年齡段，少部分甲狀腺癌患者表現(xiàn)為侵襲性生物學(xué)行為，對鄰近器官組織造成損傷，在一定程度上對預(yù)后造成影響〔5〕。有研究顯示〔6〕，若能找到甲狀腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的形成機制，可有效改善侵襲、局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，提高預(yù)后效果。

miR-191是miRNA大家族中的一員，是由22個堿基組成的非編碼小分子RNA，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程且發(fā)揮著抑癌或促癌作用，如在男性乳腺、前列腺等腫瘤中呈低表達，在胃癌、肝癌、卵巢癌中呈高表達〔7，8〕。在張丹〔9〕研究中，miRNAs具有尺寸小、穩(wěn)定性高的特點，適合作為分子標志物，其中miR-191在肺癌中呈高表達且是促癌miRNA，抑制miR-191可調(diào)控肺癌細胞侵襲和遷移能力，揭示miR-191在肺癌惡性轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能為診斷治療的新作用靶點。結(jié)果表明上調(diào)miR-191可能通過活化Notch-1信號通路，抑制細胞惡性生物學(xué)行為。細胞的增殖與凋亡是極其復(fù)雜的過程，其中包含多種子信號分及多條信號途徑，若其中一個信號分子和信號途徑出現(xiàn)缺陷，均會導(dǎo)致細胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為〔10〕。在泮雙軍等〔11〕研究中，miR-191在惡性腦膜瘤細胞中呈高表達，下調(diào)其表達可抑制惡性腦膜瘤細胞增殖，緩解疾病進展。有研究顯示〔12〕，miR-191基因的啟動子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化會導(dǎo)致其水平升高，且高表達miR-191可通過特定的機制抑制或促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，對患者預(yù)后產(chǎn)生影響，提示miR-191與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，對癌細胞生物學(xué)行為具有調(diào)節(jié)作用。本文得出，通過上調(diào)miR-191表達能夠顯著抑制甲狀腺癌的一系列細胞活動，起到抑癌的作用，進而減少甲狀腺癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后。

Notch-1信號通路是一種重要的信號通路，影響細胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程，主要涉及細胞增殖、凋亡、分化及細胞邊界的形成〔13〕。Notch-1信號通路主要由Notch配體、DNA結(jié)合蛋白、其他效應(yīng)物及Notch調(diào)節(jié)分子組成，Notch信號的產(chǎn)生主要是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，進而激活HES等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用〔14〕。Notch-1信號通路具有促癌/抑癌的雙重作用，Notch信號通路在許多癌癥中表達失調(diào)，Notch信號可通過直接調(diào)節(jié)磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)蛋白磷酸酶發(fā)揮抑癌作用〔15〕。本文研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-191可能通過活化Notch-1信號通路，調(diào)控Notch-1、HES5、Bax、Bcl-2表達量，能夠抑制甲狀腺癌細胞一系列細胞活動，使其凋亡。

綜上，上調(diào)miR-191可能通過活化Notch-1信號通路，上調(diào)Notch-1、HES5、Bax表達量，下調(diào)Bcl-2表達量，抑制細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，該發(fā)現(xiàn)有助于進一步探究甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制，為甲狀腺癌的靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。