胡乃元 歐陽華 徐巧精 王丹風(fēng) 田毅

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院麻醉科，海南 ?？?570208)

急性肺損傷(ALI)是常見的呼吸系統(tǒng)危重病癥，臨床表現(xiàn)以低氧血癥、彌漫性肺泡損傷、肺不張為主，可由肺內(nèi)(肺炎、膿毒癥等)和肺外(創(chuàng)傷等)等多種因素引起〔1〕。大量研究表明，ALI的發(fā)生機(jī)制主要與機(jī)體炎性因子釋放過度、導(dǎo)致抗炎和促炎反應(yīng)失衡有關(guān)〔2,3〕。目前用于ALI治療的常用藥物包括前列環(huán)素、一氧化氮、非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等，但療效欠佳且存在不良反應(yīng)發(fā)生率高等問題。抗膽堿藥治療是ALI輔助治療的傳統(tǒng)手段之一，其能通過抑制炎性細(xì)胞的活化，減少白細(xì)胞介素(IL)-1等炎性因子釋放，減輕ALI的臨床癥狀〔4〕。但在臨床實踐過程中研究者們發(fā)現(xiàn)，目前應(yīng)用的抗膽堿藥受體特異性較差，不良反應(yīng)多，從而限制了其推廣應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚(PHC)作為一種新型選擇性膽堿藥，不僅具有一定的抗炎作用，且可選擇性抑制M1和M3受體，為抗膽堿藥治療ALI提供了新的方向〔5〕。為進(jìn)一步探究ALI發(fā)病機(jī)制及PHC對ALI的應(yīng)用效果，本研究以失血性休克致大鼠ALI模型研究對象，探討PHC預(yù)處理對失血性休克致大鼠ALI中肺組織和血清中IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β等炎性因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1大鼠 選取50只健康SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-24，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，期間給予自由飲水和飲食，光照12 h。所有程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每個實驗程序按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2主要實驗試劑 PHC(規(guī)格：1 ml∶0.5 mg，批準(zhǔn)文號：H20051948，生產(chǎn)批號：20180511-1，生產(chǎn)廠家：成都力思特制藥股份有限公司)；IL-10、TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免吸附試驗(ELISA)試劑盒(規(guī)格均為96T，產(chǎn)品貨號分別為：E-EL-R0016c、E-EL-R0019c、E-EL-R0012c，生產(chǎn)廠家均為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；抗NF-κB、抗IκB激酶(IKK)、抗p65抗體(規(guī)格均為100 μl，產(chǎn)品貨號分別為：8242S、2697S、3033S，生產(chǎn)廠家均為Cell Signaling Technology)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(規(guī)格均為96T，產(chǎn)品貨號分別為：DEIA3918、CED026、NATE-0380，均購自北京安必奇生物科技有限公司)。

1.1.3主要儀器和設(shè)備 -80℃超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；4℃、-20℃冰箱：合肥美菱股份有限公司；H1650-W離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社；IX-71熒光倒置顯微鏡：日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社；Infinite M1000 Pro 全波長酶標(biāo)儀:TECAN公司；TANKPE060高純水機(jī)：美國Millipore公司。

1.2動物分組 50只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，稱取體重，根據(jù)體重分層隨機(jī)分成：對照組(A 組)、模型組(B 組)和PHC低劑量組(C 組，0.3 mg/kg)、中劑量組(D 組，1.0 mg/kg)和高劑量組(E 組，3.0 mg/kg)，每組10只。

1.3實驗動物模型建立 腹腔注射的水合氯醛(濃度10%，給藥劑量3.5 ml/kg)進(jìn)行麻醉。所有大鼠于右側(cè)頸動脈行穿刺置管，用于監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。選擇大鼠左側(cè)股動、靜脈進(jìn)行穿刺置管，用于給藥、放血和血液回輸。A組僅行動、靜脈穿刺，不予放血；其余各組插管后，監(jiān)測MAP，待MAP穩(wěn)定10 min后，經(jīng)動脈置管開始緩慢放血，MAP降至35～45 mmHg后，維持該MAP值60 min，回輸血液和等量生理鹽水，制備急性肺損傷模型〔6〕。C、D、E 組PHC均在放血前30 min采用股靜脈注射依劑量給予，然后按照B組方法制備急性肺損傷模型。

1.4取材 依照實驗設(shè)計方案，在大鼠復(fù)蘇4 h后，采用10%濃度水合氯醛對大鼠進(jìn)行過量麻醉，股動脈放血處死大鼠，留取血樣，靜置30 min后，4℃，1 500 r/min離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。剪取大鼠右肺置?4%濃度的甲醛溶液保存?zhèn)溆?，剪取大鼠左肺置?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)固定：將取得的肺組織標(biāo)本放置在4%濃度的甲醛溶液中充分浸泡48 h。(2)脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%酒精進(jìn)行梯度脫水；(3)透明：用二甲苯將標(biāo)本透明2次，以替換標(biāo)本組織內(nèi)酒精，此過程需不斷觀察，直至標(biāo)本透明似琥珀。(4)浸蠟：將透明標(biāo)本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65℃下保溫2 h；(5)包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中以后進(jìn)行包埋，待其冷卻凝固以后便成為蠟塊；(6)編號：記錄為標(biāo)本來源大鼠編號；(7)切片：標(biāo)本組織蠟塊用切片機(jī)在其中部自動橫行切取3張4 μm厚的薄片；(8)貼片：將切片在熱水中燙平，然后再貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h。(9)染色：在脫蠟和水洗之后，采用蘇木素進(jìn)行染色，保持3 min，繼續(xù)水洗之后再藍(lán)化，保持10 min，使用1%濃度的鹽酸酒精再進(jìn)行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min；(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次進(jìn)行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進(jìn)行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。

1.6免疫熒光 利用免疫熒光技術(shù)檢測肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)，使用1.5方法中的石蠟包埋的肺組織，抗體濃度(一抗：NF-κB抗體；1∶200 二抗：1∶400)。

1.7Western印跡 對IKK、p65肺組織中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。具體步驟：(1)取出大鼠肺組織，立即在研磨器內(nèi)加細(xì)胞裂解液放置在冰上進(jìn)行研磨，持續(xù)30 min，將混合液小心吸入到離心管中；(2)將離心管置于低溫高速離心機(jī)內(nèi)，11 000 r/min，4℃離心，持續(xù)15 min，棄沉淀，取上清；(3)將上清液收集起來，二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測蛋白濃度，依照3∶1的比例加入上樣緩沖液，再經(jīng)過沸水浴持續(xù)5 min，進(jìn)行滅活，在-20℃下儲存，以備后續(xù)使用；(4) 在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，溴酚藍(lán)區(qū)帶到達(dá)分離膠以后，電壓調(diào)至200 mA，持續(xù)2 h，溴酚藍(lán)區(qū)帶進(jìn)入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；(5) 按照20∶1的比例在PBST溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h。依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對一抗進(jìn)行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃條件下，孵育過夜；(6)采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記好的二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液，再封口，37℃條件下，孵育1 h；(7)凝膠成像分析儀掃描并分析結(jié)果。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算濃度，結(jié)果用相對灰度值表示。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS22.0 軟件，多組數(shù)據(jù)的比較采用ANOVA分析，采用 Bonferroni校正的t檢驗進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1PHC對ALI大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及肺W/D值的影響 與A組相比，B、C、D、E組血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及W/D值均明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、D、E組TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及W/D值明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及肺W/D值比較

2.2PHC對ALI大鼠肺組織病理的影響 A組肺表面光滑，鏡下肺泡規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)正常；B組肺組織較A組明顯增大，肺表面可見散在的紅色斑點，鏡下肺泡壁較A組明顯增厚，肺泡腔內(nèi)存在大量中性粒細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，病理結(jié)果提示ALI大鼠模型造模成功。C組、D組和E組肺組織的炎癥病理改變較B組明顯減輕，中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤顯著減少。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

2.3PHC對ALI大鼠肺組織中NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 Western印跡結(jié)果表明，B、C、D、E組肺組織中IKK(2.03±0.28、1.42±0.15、1.35±0.09、1.12±0.10)、p65表達(dá)(1.78±0.21、1.67±0.22、1.36±0.18、1.22±0.14)較A組IKK(1.00±0.09)和p65表達(dá)(1.00±0.12)明顯增加，而C、D、E組IKK、p65表達(dá)量較B組明顯下降(均P<0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，A組肺支氣管管壁周圍存在少量p65綠色熒光表達(dá)，B組中綠色熒光強(qiáng)度較A組明顯增加，C、D、E組綠色熒光強(qiáng)度較B組明顯減弱，提示NF-κB表達(dá)下降。見圖2、圖3?？赏茢啻笫笫а孕菘丝烧T導(dǎo)NF-κB通路激活，使IKK、P65蛋白表達(dá)增加，預(yù)防性給予PHC可以抑制NF-κB通路激活。

圖2 Western印跡檢測肺組織IKK、p65蛋白表達(dá)

圖3 免疫熒光檢測各組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)(×200)

3 討 論

有流行病學(xué)研究表明，ALI在我國ICU患者中的發(fā)病率高達(dá)10.2%，且病死率接近11.3%〔7〕。因此，進(jìn)一步探究ALI的發(fā)病機(jī)制，尋找預(yù)防和治療ALI新的安全有效的藥物具有重要的臨床意義。目前ALI發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但多數(shù)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激水平過高和炎癥反應(yīng)失控在ALI 發(fā)病中起著關(guān)鍵作用〔8～10〕。NF-κB是Rel家族二聚體蛋白的一種，在調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥介質(zhì)中具有核心轉(zhuǎn)錄因子的作用〔11〕。當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高時，可激活NF-κB通路，使通路下游的抗氧化酶(MDA、SOD、LDH)、炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10)及選擇素等基因表達(dá)增加，從而使肺血管內(nèi)皮遭到破壞，滲透性變大，引起肺組織水腫〔12～14〕。因此，阻斷NF-κB的活化對阻止炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，預(yù)防ALI 的發(fā)生、發(fā)展具有一定效果。

PHC具有抗膽堿、抗感染、抗氧化、抑制胃酸分泌等多種藥理作用〔15～17〕，已廣泛用于麻醉前給藥、有機(jī)磷中毒、慢性阻塞性肺病、內(nèi)臟平滑肌痙攣等疾病的治療〔18〕，但在ALI中的報道尚少。本研究結(jié)果提示本動物模型造模機(jī)制為大鼠失血性休克后造成NF-κB通路激活引起下游抗氧化酶和炎性細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄增加。IKK和p65是NF-κB 通路中的重要蛋白成員，抑制p65和IKK活性可以減少NF-κB 激活〔19,20〕。免疫熒光結(jié)果證實了實驗推測。通過對比PHC給藥組結(jié)果可部分說明PHC對降低ALI的發(fā)生率具有一定的預(yù)防價值，但其機(jī)制是否與抑制NF-κB通路激活、減少下游抗氧化酶和炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，尚需進(jìn)一步驗證。而進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，PHC組中NF-κB、P65 和 IKK 表達(dá)水平較B組明顯下降，驗證以上推測。

綜上，PHC可明顯減輕肺組織含水量，改善ALI大鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤和肺水腫情況，減輕肺部病理損傷，其機(jī)制可能與抑制NF-κB通路激活、減少下游抗氧化酶和炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。PHC具有較好的預(yù)防失血性休克致ALI的作用。本研究由于樣本量有限，實驗方法單一，且ALI發(fā)病復(fù)雜，仍需更大的樣本量、更豐富的實驗方法進(jìn)行驗證。