孔金玲 黃銀秋 王笑 張慧群

(1長沙市第一醫(yī)院感染科，湖南 長沙 410005；2重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心)

肺結核是肺部受到結核分枝桿菌感染造成的具有傳染性的呼吸系統(tǒng)疾病，病灶主要常見于支氣管、氣管、肺組織、胸膜部位〔1〕。結核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌中的一類，主要存在于巨噬細胞內(nèi)，表現(xiàn)于肺泡中，會導致肺部出現(xiàn)病變，若未及時治愈，可能會導致肺部癌變，造成不可挽回的后果〔2〕。一旦人體免疫力大幅度降低時，病菌則會向機體各器官侵襲，入侵肺部時，就會引起肺部結核感染，會表現(xiàn)出咳嗽、發(fā)熱等癥狀〔3〕。據(jù)不完全資料統(tǒng)計，如今肺結核的死亡率僅次于免疫缺陷病毒性疾病，具有起病急、治療困難、延遲時間長、復發(fā)率高的特點〔4，5〕。本文探究黃芩提取物對肺結核模型大鼠免疫功能的調控作用。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 45只SPF級SD大鼠，雌雄各半，購自河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司，動物許可證：SCXK(豫)2020-0004。6～9月齡，平均(7.13±1.42)月齡，體重245～310 g，平均(263.63±30.87)g，光照12 h/d，在濕度27%～36%、溫度(29.93±4.27)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w。主要試劑：黃芩提取物(南京道斯夫生物科技有限公司，貨號：dasf1545)，CD4+/CD8+、CD4+、CD8+(上海然哲儀器設備有限公司，貨號：NovoCyt)，糖類抗原(CA)125、白細胞介素(IL)-10、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海梵態(tài)生物科技有限公司，干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒購自上海彩佑實業(yè)有限公司，轉化生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，IL-6及TNF-α ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，轉錄因子(TCF)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號:FNAB08552)，糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號：ATA30403)，β-catenin抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號：ATA40133)。

1.2方法

1.2.1分組及建模 將45只SPF級SD大鼠分為正常組、模型組、低劑量組、中低劑量組、高劑量組各9只，其中正常組不進行處理，剩余4組參照王青樂等〔6〕研究構建肺結核模型：使用標準人型結核菌株H37Rv在ABSL-3級實驗室使用滴鼻法進行感染處理，菌液濃度為1×107CFU/ml，各組大鼠均滴鼻20 μl,建立肺結核大鼠模型。

1.2.2給藥 建模成功后正常組、模型組均給予3 ml生理鹽水，低劑量組給予1.5 g/kg黃芩提取物，中劑量組給予3.0 g/kg黃芩提取物，高劑量組給予6.0 g/kg黃芩提取物，1次/d，均連續(xù)灌胃2 w后觀察大鼠變化。

1.2.3病理組織學觀察 將大鼠全麻后行斷頭法處死，在低溫、無菌條件下取大鼠肺組織，將肺組織用4%多聚甲醛中浸泡、固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋，作3 μm切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色處理，使用光學顯微鏡觀察大鼠脊髓病理變化。

1.2.4CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平檢測 取大鼠尾靜脈血2 ml，使用肝素鈉行抗凝處理，使用流式細胞儀檢測，將EDTA抗凝外周靜脈血100 μl加入4個試管中,1個試管加入CD和CDg雙標記單克隆抗體20 μl,另3個試管分別加入CD4+/CD8+、CD4+、CD8+單克隆抗體20 μl,充分混勻,孵育26℃ 15 min后,加入600 ml紅細胞溶解液溶解10 min,以1 200 r/min，離心5 min除去上清,將細胞懸浮在500 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行流式細胞儀分析。

1.2.5胸腺指數(shù) 采用胸腺指數(shù)測定，將大鼠胸腺完全剝離，采用電子天平檢測重量，計算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)=胸腺質量/體重。

1.2.6CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平檢測 取右肺組織，用PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于12 000 r/min離心機中4℃離心15 min，收集上清液于-80℃儲存，沸水煮5 min，室內(nèi)4℃保存。采用ELISA檢測，取50 mmol/L碳酸鹽包緩沖液稀釋抗原加入聚苯乙烯反應孔，加蓋處理。4℃環(huán)境內(nèi)靜置24 h，次日取出洗滌3次拋干，添加對照標本、0.1 ml待檢標本，42℃條件下放置1 h，洗滌拋干，在每孔中加入低物液均勻，加入0.1 ml鄰苯二胺遮光處理20 min，加入1 ml H2SO4，終止反應，經(jīng)繪制標準曲線計算CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.2.7Western印跡檢測TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白 取所有大鼠肺組織蛋白，提取50μg蛋白，加入蛋白緩沖液內(nèi)，提取常規(guī)蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法對其進行定量分析。凝膠電泳、轉膜，取膜，4 ℃下固定、封閉處理1 h，TCF、GSK-3β、β-catenin和內(nèi)參β-actin蛋白在室內(nèi)封閉90 min,按1∶1 000加入TCF抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、β-actin抗體，以1∶2 000加入c-fos抗體,4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為 1 h，TBST連續(xù)洗膜3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1病理組織學觀察 正常組HE染色未發(fā)現(xiàn)病變。模型組實變內(nèi)肉芽腫樣病變形成，鏡下見多核巨細胞多發(fā)淋巴細胞浸潤，低劑量組伴大量泡沫細胞和巨噬細胞浸潤；多核巨細胞、類上皮細胞上升，有結核小結形成，中劑量組在實變組織內(nèi)見散在類上皮細胞形成，多核巨細胞較少，并有結核小結形成趨勢，高劑量組可見肺泡間隔增寬，少量淋巴細胞浸潤，中性粒細胞和巨噬細胞散在分布。見圖1。

圖1 各組肺組織病理觀察(HE染色，×400)

2.2各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數(shù)水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯低于正常組，CD8+水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯高于模型組，CD8+水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯高于低劑量組，CD8+水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯低于高劑量組，CD8+水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見表1。

2.3各組CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數(shù)、CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較

2.4各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較 相比于正常組，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與高劑量相比，中劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.5各組Wnt/β-catenin信號通路蛋白基因表達比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯高于正常組(均P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯降低于模型組(均P<0.05)；中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯低于低劑量組(均P<0.05)；中劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平及Wnt/β-catenin信號通路蛋白基因表達量比較

1～5:正常組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組圖2 Western印跡檢測各組細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白

3 討 論

結核病嚴重的會引起全身器官的病變，其中肺結核是結核病中發(fā)病率最高的一種，該病感染率、耐藥率、死亡率均極高，一旦發(fā)病，將對患者的生命健康會造成及極嚴重的影響〔7,8〕。本研究提示，肺結核的發(fā)病與免疫體功能之間存在著一定的關系，機體免疫功能的降低會導致該病的發(fā)生及發(fā)展，同時，通過提升患者免疫功能也能較好地改善及抑制病情。

黃芩中提取的成分有漢黃芩苷、黃芩苷、黃芩新素、黃芩素、漢黃芩素等，其中黃芩苷的含量較高并作為藥典中黃芩質量標準的檢測指標。黃芩具有清熱燥濕，瀉火清心、涼血活血的功效，對人體有抗菌、抗病毒、清熱燥濕的功效。抗病毒、抗菌：黃芩對革蘭陰性菌、致病性皮膚真菌、革蘭陽性菌有抑制作用。而且黃芩還能抑制乙型肝炎病毒、流感病毒等；清熱燥濕：可用于濕溫發(fā)熱、濕熱瀉痢、濕熱、胸悶、口渴不欲飲等病癥〔9〕?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，黃芩有解熱作用，在抗菌、抗感染、抗病毒等藥理過程中均有體現(xiàn)。本文研究說明，高劑量岑提取物可有效改善肺結核模型大鼠免疫功能，抑制通路因子的異常表達，調節(jié)機體免疫反應，效果顯著。

CD4+屬于T細胞亞群，表達于T細胞受體中，一定程度上能夠反映出機體的免疫功能，參與肺結核的發(fā)病〔10〕。同時CD4+還能夠起到激活CD8+的作用，對于細菌的侵襲感染均具有較好的抵抗效果，提升患者的免疫功能，且一定程度上還能消滅肺結核致病菌〔11〕。CD8+T細胞在被CD4+激活后，會參與機體的免疫系統(tǒng)中，參與抗結核病的保護機制中，能夠有效抑制細菌的增殖〔12,13〕。本研究說明高劑量芩提取物對肺結核模型大鼠CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平有一定的調控作用，效果顯著。

CA125是一種高分子量糖蛋白,其在機體眾多細菌性疾病及免疫性疾病中均呈現(xiàn)異常表達〔14，15〕。IFN-γ在機體眾免疫系統(tǒng)中均存在一定的調節(jié)作用，能夠增強細胞的免疫功能〔16,17〕。TGF-β是重要的致肺纖維化細胞因子，活化TGF-β因子在肺纖維化細胞間質膠原的合成和分解、增殖和分裂中發(fā)揮重要作用〔18〕。IL-6可誘導B細胞分化和抗體產(chǎn)生，在機體免疫應答中起到一定作用〔19〕。TNF-α是巨噬細胞產(chǎn)生的急性炎癥細胞因子〔20〕。IL-10由B細胞、單核巨噬細胞等產(chǎn)生，屬于抑制炎癥反應的細胞因子，在慢性病程中可以抑制細胞介導的免疫應答〔21〕。本文結果說明高劑量岑提取物可有效抑制肺結核模型大鼠CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平，可有效降低炎癥反應，抑炎因子產(chǎn)生，效果顯著。Wnt通過自分泌發(fā)揮作用，是分泌型糖蛋白。Wnt信號通路在多種細胞增殖再生、分化、遷移中起著重要的調節(jié)作用。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路參與了肺癌和纖維化的發(fā)生發(fā)展，在肺泡巨噬細胞抗感染中發(fā)揮免疫調控作用，其長鏈非編碼RNA是轉錄長度>200 nt的RNA分子，不能直接編碼蛋白質，但能抑制染色質重塑、參與轉錄、轉錄后水平上調控基因表達〔22〕。本研究顯示，高劑量黃芩提取物可有效抑制肺結核模型大鼠Wnt/β-catenin信信號通路蛋白基因表達量，從而控制其大鼠病情發(fā)展。

綜上，黃芩提取物通過作用于Wnt/β-catenin信號通路，調控TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達，可有效改善免疫功能的異常表達及炎癥反應。