梁倩 高虹 李海

(1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，廣西 南寧 530100;2寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室;3右江民族醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)

人和大多數(shù)哺乳動物的部分腦區(qū)產(chǎn)生新神經(jīng)元的過程謂之神經(jīng)發(fā)生〔1〕，海馬齒狀回(DG)的顆粒下層是目前研究最多的神經(jīng)發(fā)生區(qū)之一。研究表明，外周注射脂多糖(LPS)抑制DG區(qū)海馬的神經(jīng)發(fā)生〔2～4〕。但是，LPS抑制DG區(qū)海馬神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制卻鮮有報道，本研究擬從在離體和體內(nèi)水平觀察LPS對海馬DG神經(jīng)發(fā)生的影響，一方面原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)前體(NPCs)細(xì)胞，鏡下觀察神經(jīng)球減少的數(shù)目，另外在體水平上大鼠腹腔注射LPS，用5溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記DG區(qū)的增殖細(xì)胞、雙皮質(zhì)醇(DCX)標(biāo)記神經(jīng)元、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞、鈣接頭蛋白分子(Iba1)標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞變化的數(shù)目以追蹤觀察這些細(xì)胞的存活和分化狀況，探討增殖細(xì)胞減少的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 48只少年期雄性SD 大鼠，體重100～200 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機(jī)分成實驗組(LPS組，n=30)、生理鹽水對照組(NS組，n=18)，按腹腔注射LPS和BrdU的先后時間，實驗組分為：①先注射LPS后BrdU標(biāo)記(下簡稱先LPS后BrdU)組；②先Brdu標(biāo)記后注射LPS(下簡稱先BrdU后LPS)組；③僅注射LPS組。對照組分為④先注射生理鹽水(NS)后BrdU標(biāo)記(下簡稱先NS后BrdU)組；⑤先BrdU標(biāo)記后注射NS(下簡稱先BrdU后NS)組；⑥僅注射NS組。每組分1、3、5、7 d四個時程。

1.2主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、B27(Gibco公司)；表皮生長因子(EGF)、多聚賴氨酸、LPS、BrdU、BrdU抗體(Sigma公司)；鈣接頭蛋白分子(Iba-1)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、雙皮質(zhì)醇(DCX)抗體、神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)抗體、Toll樣受體(TLR)4抗體(Abcam公司)。

1.3LPS誘發(fā)炎癥 NS組與LPS組均分別進(jìn)行腹腔注射NS或LPS 1.0 mg/kg (溶于無菌生理鹽水)，觀察LPS誘導(dǎo)的炎癥對NPCs存活與分化的影響和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1.4大鼠發(fā)育變化觀察 腹腔注射生理鹽水或LPS前3天開始，每天用電子天平稱量大鼠體重，連續(xù)觀察9 d。

1.5BadU標(biāo)記 NS組與LPS組均分別行腹腔注射NS或LPS后第1、3、5、7天進(jìn)行BrdU 200 mg/kg (溶于無菌生理鹽水)2 h，后于相應(yīng)的時間點(diǎn)分別處死動物。

1.6組織切片制備 動物麻醉后，依次用(0.01 mol/L)PBS和4%多聚甲醛溶液(PFA)灌流，斷頭取腦，將腦組織置于4% PFA 中后固定6～8 h后，轉(zhuǎn)移到20%的蔗糖溶液中4℃過夜至腦塊自然下沉。冰凍切片，自前囟后2.3 mm把含有齒狀回的海馬部分做連續(xù)冠狀切片，片厚40 μm，每6張切片取1張用于免疫組織化學(xué)染色。

1.7NPCs的分離和培養(yǎng)沿用本實驗室分離和培養(yǎng)NSCs的方法，將新生SD大鼠(0～2 d)置于75%的乙醇中浸泡消毒1～2 min后斷頭取腦，在超凈臺內(nèi)用4℃平衡鹽溶液(HEBSS)洗兩次。在解剖顯微鏡下剝離腦膜和血管，切取海馬組織塊，制成單細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入培養(yǎng)基(1∶1 DMEM/F12，2%B27)，添加EGF 20 ng/ml，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。以后每3 d半量換液一次，并添加新鮮的EGF。細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d后形成原代神經(jīng)球。將原代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)5～7 d形成次代神經(jīng)球。取次代神經(jīng)球進(jìn)行實驗。

1.8免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色

1.8.1BrdU免疫組織化學(xué) 冰凍切片經(jīng)2 mol/L鹽酸(37℃，30 min) 變性、0.1%胰酶(37℃，20 min)消化后，2%～3%的BSA室溫封閉30 min，棄液后直接加入小鼠抗BrdU單克隆抗體(1∶200)室溫孵育20 h，加入生物素化的羊抗鼠二抗IgG(1∶200)，室溫孵育2 h，隨后加入ABC(1∶200)室溫下孵育2 h，最后將切片放入含終濃度為0.03%過氧化氫的0.05%二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液中顯色5～8 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)終止顯色。各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次。常規(guī)貼片，風(fēng)干，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.8.2BrdU和DCX或GFAP免疫熒光雙標(biāo) 冰凍切片同上進(jìn)行變性、消化、封閉后，同時加入小鼠抗BrdU單克隆抗體(1∶200)和兔抗DCX多克隆抗體(1∶500)，室溫下共同孵育20 h，經(jīng)PBS充分漂洗后同時加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗小鼠熒光二抗(1∶500)和Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗(1∶500)，避光、室溫下共同孵育2 h，PBS漂洗后用50%緩沖甘油封片，在共聚焦顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞的表達(dá)并拍照。

1.8.3TLR4、Iba1免疫組織化學(xué)染色冰凍切片至室溫后放入3%過氧化氫，避光 30 min；PBS清洗后，加兔抗TLR4抗體(1∶200)、羊抗Iba1(1∶1 000)孵育，4℃過夜。次日復(fù)溫和清洗3次后加入滴加熒光二抗，室溫避光孵育2 h，封片劑封片。

1.8.4Nestin、TLR4免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測將次代神經(jīng)球移至PLL包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液用4%多聚甲醛固定15 min 0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗3遍加入1∶2 000的兔抗nestin單抗、兔抗TLR4抗體(1∶200)4℃孵育過夜，漂洗3遍后加入二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶200)，室溫孵育2 h后，漂洗3遍后用DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LPS對大鼠體重的影響 NS組自給生理鹽水前3 d開始，連續(xù)觀察9 d其體重呈直線上升趨勢。LPS組注射LPS 1 d體重突然減輕，第2天馬上恢復(fù)至給藥前水平，之后其體重平穩(wěn)增長，見表1，體重增長曲線與NS組相平行。LPS誘發(fā)炎癥7 d，大鼠日均體重生長較NS組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即大鼠受到LPS刺激后，其生長發(fā)育減慢。

表1 腹腔注射LPS對大鼠體重的影響

2.2LPS影響DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，NS組DG區(qū)小膠質(zhì)Iba1陽性細(xì)胞為纖細(xì)分支狀，胞體小，具有伸向各個方向的細(xì)胞突起；LPS組腹腔注射LPS后第1天DG區(qū)小膠質(zhì)Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞變?yōu)楦叻种?，表現(xiàn)為胞體變大，突起及其分支變短且增多、增長增粗，著色最深；隨著誘發(fā)炎癥時間的延長，實驗組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，胞體縮小，突起變短變細(xì)，分支減少，著色漸漸變淡。見圖1。

圖1 LPS誘發(fā)炎癥影響小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化(免疫組化染色)

2.3LPS對海馬DG顆粒下層(SGZ)區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖影響的時程變化 NS組1、3、5、7 d BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目分別為(118.6±8.85)個,(107.4±9.5)個,(105.4±9.3)個,(106.3±11.4)個。LPS組注射后1 d，細(xì)胞數(shù)減少到(88.7±9.5)個；之后開始漸漸恢復(fù)，至第3天為(95.8±6.5)個；5、7 d，陽性細(xì)胞數(shù)目保持在正常水平為(106.7±6.2)個和(104.3±8.7)個。與NS組相比，LPS組BrdU免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)第1天明顯減少(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組注射后各時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞(免疫組化染色，×40)

2.4海馬DG顆粒下層BrdU標(biāo)記的細(xì)胞被LPS刺激持續(xù)刺激7 d其增殖和分化 注射LPS 2 h后再注射BrdU 7 d，與NS組相比，LPS組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。

圖3 海馬DG顆粒下層BrdU標(biāo)記的細(xì)胞被LPS持續(xù)刺激7d，共聚焦結(jié)果顯示DG區(qū)BrdU+/DCX+細(xì)胞的表達(dá)(免疫熒光雙標(biāo),×200)

圖4 海馬DG顆粒下層BrdU標(biāo)記的細(xì)胞被LPS持續(xù)刺激7 d，共聚焦結(jié)果顯示DG區(qū)BrdU+/GFAP+細(xì)胞的表達(dá)(免疫熒光雙標(biāo),×200)

表2 兩組BrdU+細(xì)胞及共聚焦結(jié)果顯示DG區(qū)BrdU+/DCX+細(xì)胞及BrdU+/GFAP+細(xì)胞的表達(dá)

2.5BrdU 和DCX、GFAP的共表達(dá) 免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，注射LPS 2 h后再注射BrdU 7 d，海馬顆粒細(xì)胞層發(fā)現(xiàn)少量BrdU 和DCX、GFAP雙陽性細(xì)胞，大多數(shù)的BrdU陽性細(xì)胞都表達(dá)DCX。NS組BrdU和DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)為(84.8±5.4)%， BrdU和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為(3.7±0.7)%；LPS組BrdU和DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)為(86.3±7.1)%，BrdU和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為(4.1±1.2)%；兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6LPS的受體TLR4在神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)前體細(xì)胞上的表達(dá) 細(xì)胞免疫組化和組織免疫熒光的結(jié)果顯示，離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞和大鼠海馬DG顆粒細(xì)胞下層都發(fā)現(xiàn)TLR4陽性細(xì)胞，見圖5。提示BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目的減少可能與LPS刺激引起的TLR4信號傳導(dǎo)通路的激活有關(guān)。

a：TLR4 在DG的表達(dá)(免疫熒光染色)；b：神經(jīng)球Nestin 的表達(dá)； c：神經(jīng)球TLR4表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色)圖5 TLR4在DG、原代培養(yǎng)神經(jīng)球的表達(dá)(×200)

3 討 論

傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個能夠逃離免疫監(jiān)視的一個特殊區(qū)域。然而，近來的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的NPCs在炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)的退行性傷害過程中，NPCs調(diào)節(jié)自身的遷移和分化潛能〔5〕，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞提供的炎癥信號和抗原特異性T細(xì)胞調(diào)控著胚胎CNS區(qū)域神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生〔6～8〕。

本實驗說明正常情況下，處于靜止?fàn)顟B(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的遷移能力，在炎癥激活過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞作為定居于大腦中的巨噬細(xì)胞，開始改變形態(tài)而被激活。在大腦的其他區(qū)域如：丘腦、皮層、海馬沒有觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，說明DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是特異性的。GFAP在形態(tài)和數(shù)目上并沒有變化說明LPS并不誘導(dǎo)GFAP的激活，說明小膠質(zhì)細(xì)胞是LPS優(yōu)先選擇的細(xì)胞目標(biāo)。LPS誘導(dǎo)DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的改變，說明海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生的環(huán)境已經(jīng)發(fā)生改變。

BrdU 是一種合成性胸腺嘧啶類似物，它能在細(xì)胞分裂的DNA 合成期(S 期)有效地?fù)饺隓NA 中，使新生細(xì)胞可通過BrdU 免疫組織化學(xué)染色法顯示。有研究報道，成年大鼠SGZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖周期為25 h，5、7 d處于有絲分裂后時期〔9〕，本實驗說明，LPS對DG區(qū)前體細(xì)胞的作用僅僅發(fā)生在增殖階段，LPS誘使BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目的減少是急性的，短時間的。一些研究表明外周注射LPS 1 w以內(nèi)，能夠抑制DG的神經(jīng)發(fā)生〔3,4〕，本研究表明內(nèi)毒素能誘發(fā)快速的抑制效應(yīng)，LPS注射24 h能顯著抑制BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目，另外注射LPS 2 h后再注射BrdU 7 d，海馬DG顆粒下層BrdU標(biāo)記的細(xì)胞被LPS刺激持續(xù)刺激7 d，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少也說明了這一點(diǎn)。這個結(jié)果與大鼠和猴一些心理應(yīng)激的結(jié)果是一致的〔10,11〕。也不排除LPS誘導(dǎo)的炎癥導(dǎo)致細(xì)胞死亡的可能性，有文獻(xiàn)報道，BrdU陽性細(xì)胞的減少可能是因為新生細(xì)胞的死亡〔12〕。Bain等〔13〕證實急性應(yīng)激減少大鼠BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，而相同的應(yīng)激卻增加小鼠BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。LPS已經(jīng)被證實能夠產(chǎn)生普遍的應(yīng)激反應(yīng)，如發(fā)熱〔14〕、腦內(nèi)細(xì)胞因子〔15,16〕的產(chǎn)生、下丘腦-垂體-腎上腺〔17,18〕的激活，下丘腦-垂體-性腺〔17,19〕的抑制，在大鼠和小鼠身上，LPS對BrdU陽性細(xì)胞的不同效應(yīng)說明了LPS對神經(jīng)發(fā)生種屬特異性。

本實驗結(jié)果說明，LPS誘導(dǎo)的急性炎癥過程不能改變成年大鼠DG區(qū)新生神經(jīng)前體細(xì)胞分化。然而，有研究發(fā)現(xiàn)LPS能抑制神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，但不改變其向GFAP分化的命運(yùn)推測結(jié)果不同的原因有：①本實驗僅注射1次BrdU(200 mg/kg)，后者連續(xù)3次每隔8 h(200 mg/kg)或者8次每隔2 h(50 mg/kg)注射BrdU，海馬神經(jīng)發(fā)生是不斷進(jìn)行的持續(xù)過程，單次進(jìn)行BrdU標(biāo)記的細(xì)胞只能標(biāo)記某個時間點(diǎn)的處于細(xì)胞分裂周期S期的細(xì)胞；多次BrdU標(biāo)記能將持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂和增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記。所以本實驗BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目少于其他研究結(jié)果。本實驗結(jié)果與其他研究結(jié)果不一致可能來源于單次BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)太少造成的結(jié)果不一致。②在小鼠上，另一方面，注射LPS 7 h內(nèi)不影響B(tài)rdU陽性細(xì)胞數(shù)目，但是在7 h和28 d后能減少BrdU陽性細(xì)胞數(shù)〔20〕，本實驗表明LPS誘發(fā)炎癥效應(yīng)在短短2 h內(nèi)還不足以影響B(tài)rdU標(biāo)記的神經(jīng)前體細(xì)胞的分化走向，LPS誘發(fā)炎癥效應(yīng)對神經(jīng)發(fā)生的抑制效用需要更長時間。也不排除不一致可能與LPS與BrdU在體內(nèi)攝取效率不同有關(guān)。在嚙齒動物成年海馬神經(jīng)發(fā)生區(qū)域的NPCs感受入侵的炎癥代理(可能通過TLRs)調(diào)節(jié)自身的增殖和分化能力是目前研究的熱點(diǎn)之一。了解炎癥發(fā)應(yīng)對NPCs的增殖和分化能力的影響有利于通過細(xì)胞移植治療急性或慢性疾病。本實驗結(jié)果說明TLR4可能調(diào)節(jié)著神經(jīng)干/前體細(xì)胞上的神經(jīng)發(fā)生。而在體的實驗也同樣發(fā)現(xiàn)在少年期正常大鼠DG區(qū)低表達(dá)TLR4。

綜上，LPS誘導(dǎo)的炎癥效應(yīng)能夠抑制神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，但是并不影響新生的神經(jīng)前體細(xì)胞分化。LPS的這種效應(yīng)可能通過激活TLR4途徑抑制神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。TLRs不僅參與識別廣泛的入侵分子(如細(xì)菌、真菌和病原體的微生物產(chǎn)品)同樣監(jiān)視著損傷和啟動組織修復(fù)，可以設(shè)想NPCs同樣參與保護(hù)大腦免受損傷的信號傳導(dǎo)過程。