郭嘉 卞華 單雨 趙晶晶 張瀟文 陳爽 卞博

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000；2南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)主要累及關(guān)節(jié)，但仍應(yīng)認(rèn)為是一種包括關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的綜合征，如類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺部受累或血管炎及全身并發(fā)癥〔1〕。RA有著嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，除了主要的直接醫(yī)療費(fèi)用外，還有功能殘疾、工作能力減少和社會參與度下降的結(jié)果〔2〕。甲氨蝶呤通常是RA的一線藥物，生物制劑如腫瘤壞死因子抑制劑，通常被認(rèn)為是二線藥物或可以添加雙重治療〔3〕。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)取得了不錯的進(jìn)展，但由于藥物療效的不確切性及不良反應(yīng)的可預(yù)見性，我們?nèi)孕璨粩嗤晟坪屯诰蛐碌闹委煵呗砸愿纳芌A患者預(yù)后。

中醫(yī)認(rèn)為RA屬“痹證”范疇，歷代醫(yī)家又稱其為 “血痹”“鶴膝風(fēng)”“白虎歷節(jié)”等。漢代張仲景在《金匱要略》中指出：“血痹，陰陽俱微，寸口關(guān)上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風(fēng)痹狀，黃芪桂枝五物湯(HQGZ)主之。”有關(guān)Meta分析顯示〔4〕，HQGZ聯(lián)合西藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎比單用西藥有更好的療效，且不良反應(yīng)顯著降低。多項(xiàng)臨床研究〔5～7〕顯示，HQGZ在RA治療中具有顯著的減毒增效作用。劉佳維等〔8〕研究表明，HQGZ能明顯減輕模型組大鼠關(guān)節(jié)炎癥、滑膜增生、血管翳形成及軟骨破壞,其機(jī)制可能與調(diào)控janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活物(JAK-STAT)信號通路中白細(xì)胞介素(IL)-2、JAK3、STAT3、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)1、SOCS3的表達(dá)相關(guān)。中西醫(yī)結(jié)合治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎突破中西藥各自用藥治療的局限性，可提高療效，降低致殘率，提高生活質(zhì)量〔9〕，因此對于中醫(yī)藥防治RA的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。目前HQGZ治療RA的具體機(jī)制尚不清楚，本研究旨在探討HQGZ對RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1RA靶點(diǎn)獲取 通過GEO數(shù)據(jù)庫，以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索相關(guān)芯片，獲取GSE93272、GSE93776的芯片數(shù)據(jù)原始文件和GPL570-55999的芯片基因注釋文件。GSE93272芯片包含了275個樣本，其中232個來自RA患者，43個來自健康人群；GSE93776包含173個樣本，其中83個來自RA患者，90個來自健康人群。使用R軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，過濾條件為|logFC|>0.5，P值<0.05，獲得RA潛在靶點(diǎn)并分別繪制熱圖。登錄OMIM數(shù)據(jù)庫和Genecard數(shù)據(jù)庫，輸入“Rheumatoid arthritis”檢索獲取RA靶點(diǎn)基因。最后去除重復(fù)靶點(diǎn)，整合獲得RA靶點(diǎn)。

1.2HQGZ靶點(diǎn)獲取及靶點(diǎn)預(yù)測 登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別輸入黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗，以口服利用度(OB)>30%，類藥性(DL)>0.18為過濾條件進(jìn)行篩選，并獲取其所對應(yīng)的靶點(diǎn)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對所獲得的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。將RA靶點(diǎn)與HQGZ靶點(diǎn)取交集，獲取有效靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?將預(yù)測的有效靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行PPI分析，過濾條件為最低互動得分要求>0.9，除去在網(wǎng)絡(luò)中無連接的點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。保存TSV文件，使用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，過濾條件為中介中心度、接近中心度、程度中心性、特征向量中心度、基于局部平均連接度的方法、信息中心度及網(wǎng)絡(luò)中心性，每次過濾選取大于中位值的節(jié)點(diǎn)，最終獲取核心基因。

1.4分子對接驗(yàn)證 將獲取的核心基因BC排名前3的靶點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)圖中DC排名前6的有效成分分別進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。登錄PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，去掉小分子配體。登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫，下載有效成分2D結(jié)構(gòu)。經(jīng)Autodock軟件處理后獲取PDBQT文件，進(jìn)行分子對接。選取結(jié)合能最小的組合使用PYMOL軟件繪圖。

1.5基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析 將預(yù)測的有效靶點(diǎn)通過R軟件中的ClusterProfiler包〔10〕對獲得的RA潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組份(CC)和KEGG通路分析，對P值進(jìn)行錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)矯正獲得adjP的值，設(shè)置閾值adjP<0.05為過濾條件。并繪制排名靠前的通路圖。

2 結(jié) 果

2.1RA潛在靶點(diǎn) 通過GSE93776、GSE93272的芯片數(shù)據(jù)對比RA患者與健康人基因差異，分別獲取差異基因115個和238個，繪制熱圖，見圖1、圖2。登錄Genecard數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“Rheumatoid arthritis”，分別獲取RA靶點(diǎn)4 157個靶點(diǎn)、48個靶點(diǎn)。刪除重復(fù)基因，整理后獲得4 439個靶點(diǎn)基因。

圖1 GSE93272

圖2 GSE93776

2.2HQGZ治療RA有效靶點(diǎn)預(yù)測 獲取有效成分黃芪20個、桂枝7個、芍藥13個、生姜5個及大棗29個，其中槲皮素為黃芪、大棗共有成分，山柰酚為黃芪、芍藥共有成分，β-谷甾醇為桂枝、芍藥、生姜、大棗共有成分，豆固醇為生姜、大棗共有成分，(+)兒茶素為大棗、桂枝、芍藥共有成分，谷甾醇桂枝、芍藥共有成分，丁子香萜為黃芪、芍藥、大棗共有成分。所對應(yīng)作用靶點(diǎn)去除重復(fù)并經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化命名后共獲取213個。將HQGZ靶點(diǎn)與RA靶點(diǎn)取交集獲取147個有效靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件繪制中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，芒柄花黃素、異鼠李素、β-胡蘿卜素在網(wǎng)絡(luò)中度值較高，為主要有效成分。

(中心矩形節(jié)點(diǎn)為HQGZ中藥有效成分，圓形標(biāo)記中生姜深藍(lán)色，黃芪黃色，桂枝綠色，大棗紅色，芍藥淺藍(lán)色；兩個同心圓節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小與其在網(wǎng)絡(luò)中的度值呈正相關(guān))圖3 中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將預(yù)測的有效靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。通過Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出核心靶點(diǎn)JUN、MYC、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、RELA、MAPK8、細(xì)胞周期素(CCND)1、蛋白激酶B(Akt)1、雌激素受體(ESR)1、腫瘤蛋白(TP)53、連環(huán)蛋白(CTNN)β1、NF-κB抑制劑α(NFKBIA)。

2.4分子對接驗(yàn)證 將核心靶點(diǎn)前3的JUN、MYC、MAPK14靶點(diǎn)分別與HQGZ主要有效成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，芒柄花黃素、異鼠李素、β-胡蘿卜素做分子對接。結(jié)果見表1。若結(jié)合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能越小對接越好。據(jù)表中數(shù)據(jù)可知，最低結(jié)合能均≤-5.9 kCal/mol，說明配體與受體蛋白結(jié)合性良好。其中MAPK14與Beta-carotene對接為最低結(jié)合能。

表1 分子對接結(jié)果

2.5GO和KEGG通路分析 將有效靶點(diǎn)標(biāo)注后，作流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路圖見圖4及PI3K-Akt信號通路圖見圖5。將預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，將富集結(jié)果排名靠前的結(jié)果作圖，見圖6，圖7。通過GO功能富集分析得到 GO條目2 652個(P<0.05)，其中BP條目2 348個，涉及應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等方面；CC條目96個，涉及細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器等方面；MF相關(guān)的條目208個，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、結(jié)合活性、分子功能調(diào)節(jié)、催化活性等方面。KEGG通路富集分析顯示HQGZ治療RA涉及161條通路，且通路之間相互交叉影響。

圖4 流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路

圖5 PI3K-Akt信號通路

圖6 有效靶點(diǎn)GO富集分析

圖7 有效靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為素體正氣虧虛是RA產(chǎn)生的先決條件，加之風(fēng)、寒、濕三邪侵襲機(jī)體，正氣虧虛無力驅(qū)邪外出，使病邪稽留體內(nèi)，病久成瘀，加之濕邪纏綿，因而病勢纏綿難愈。首批全國名老中醫(yī)婁玉鈴等〔11〕就曾提出治療風(fēng)濕病當(dāng)從“虛、邪、瘀”三方面出發(fā)。HQGZ中以黃芪為君，益氣活血、溫陽化濕，佐以桂枝溫陽散寒、和血通絡(luò)，合白芍養(yǎng)血緩急，柔筋止痛，重用生姜助桂枝祛風(fēng)散寒、溫經(jīng)止痛，加以大棗調(diào)和脾胃，生化氣血，配方精簡共奏益氣養(yǎng)血、溫經(jīng)通絡(luò)、和血通痹之功效。

纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLSs)的異常遷移和侵襲是RA最主要的發(fā)病機(jī)制之一，研究顯示〔12〕槲皮素可通過調(diào)控miR-146a/GATA6軸抑制FLSs的遷移和侵襲。槲皮素還可抑制IL-17刺激的RA-FLS中RANKL的產(chǎn)生和IL-17刺激破骨細(xì)胞的形成，降低Th17的分化〔13〕。有臨床研究顯示〔14〕每天服用500 mg槲皮素，持續(xù)8 w，可以顯著改善RA患者的臨床癥狀、疾病活性，降低血漿高敏感性腫瘤壞死因子水平和健康評估問卷評分。同樣，山柰酚在治療RA中可以抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,通過抑制核因子(NF)-κB和Akt/mTOR通路改善炎癥RA-FLS〔15〕。另一項(xiàng)研究表明〔16〕，山奈酚可通過阻斷MAPK通路的激活抑制了FLSs在RA中的遷移和侵襲。氧化損傷與RA和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，Comstock等〔17〕曾研究發(fā)現(xiàn)，RA或系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中α-生育酚、β-胡蘿卜素和視黃醇的濃度低于非RA或系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，即抗氧化狀態(tài)是RA的危險(xiǎn)因素。篩選出核心靶點(diǎn)后進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示受體與配體結(jié)合度緊密，從側(cè)面驗(yàn)證了本研究預(yù)測的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)HQGZ治療RA可能是通過多成分多靶點(diǎn)共同作用，起到抗炎止痛、調(diào)節(jié)免疫的功效。

RA患者的心血管事件是一般人群的1.5～2.0倍，心血管事件是RA患者死亡的主要原因〔18〕。炎癥是RA的一個特征，會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的激活，活化的ECs通過增加白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)而誘發(fā)動脈粥樣硬化〔19〕。本研究顯示HQGZ治療RA富集程度較高的通路中流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路居第一。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞通過縫隙連接蛋白血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1、細(xì)胞表面糖萼、初級纖毛、離子通道、小窩和G蛋白、細(xì)胞骨架蛋白和整合素〔20,21〕等機(jī)械傳感器識別切應(yīng)力。在機(jī)械傳感的基礎(chǔ)上，剪切力通過誘導(dǎo)細(xì)胞信號事件的級聯(lián)和改變基因表達(dá)模式來調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)。其中通過產(chǎn)生和清除活性氧(ROS)和一氧化氮來調(diào)節(jié)氧化還原平衡是切應(yīng)力作為一種有效的促動脈粥樣硬化或抗動脈粥樣硬化刺激的關(guān)鍵機(jī)制〔22〕。現(xiàn)已有研究〔23,24〕表明，黃芪桂枝五物湯聯(lián)合西藥在治療心肌梗死方面能夠顯著降低氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)水平,降低過氧化損傷程度,保護(hù)血管內(nèi)皮功能，增強(qiáng)治療效果,改善心功能和中醫(yī)證候,減少心血管不良事件發(fā)生。這也從側(cè)面驗(yàn)證了HQGZ可能在治療RA過程中不僅能夠起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功效，也能夠改善RA患者的心血管風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后。

PI3K-Akt信號通路是已知與RA發(fā)病聯(lián)系較為密切通路之一。RA的病情進(jìn)展主要表現(xiàn)為成纖維滑膜細(xì)胞大量增殖分化，產(chǎn)生炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，激活血小板，并刺激血小板微顆粒向關(guān)節(jié)腔中釋放血小板活化產(chǎn)物，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路，影響多種下游效應(yīng)分子的激活過程，從而抑制滑膜細(xì)胞自噬〔25〕。有研究顯示RA患者滑膜細(xì)胞中Akt存在過度表達(dá)，而PI3K作為Akt的上游分子，能夠活化Akt。Akt通過磷酸化激活多種靶蛋白產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)〔26,27〕。因此HQGZ可能通過抑制PI3K/Akt信號通路進(jìn)而促進(jìn)成纖維滑膜細(xì)胞凋亡并抑制其異常增殖的作用。從通路圖中我們可以看到通路涉及多項(xiàng)炎癥及免疫相關(guān)通路如MAPK信號通路、NF-κβ信號通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞黏附分子通路、p53信號通路、VEGF信號通路、Toll樣受體信號通路等。同時在人類巨細(xì)胞病毒感染通路方面，已有研究表明巨細(xì)胞潛伏感染的存在會影響RA臨床病程和預(yù)后〔28～30〕。

本研究可知HQGZ治療RA是通過多成分多靶點(diǎn)作用于多通路后的共同結(jié)果，且在治療過程中可能會減輕心血管并發(fā)癥，提高患者預(yù)后，這也正體現(xiàn)了中醫(yī)異病同證、異病同治的思想。本研究結(jié)果為今后挖掘HQGZ治療RA的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。因數(shù)據(jù)庫使用有限，可能造成結(jié)果存在差異，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。