王寶 趙暉 賈春祎 趙鑫 鄒勤光 孫少林 王啟文 (吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130000)

肺癌是臨床中最為常見的惡性腫瘤，目前在已知的惡性腫瘤中，發(fā)病率和死亡率均居首位，每年全球超過90萬人因該病死亡，已成為嚴(yán)重的公共健康問題〔1〕。肺癌本身具有侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在疾病早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大部分肺癌患者就診時(shí)多已發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔2〕。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，但該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今未能完全闡明其發(fā)病的深層機(jī)制〔3,4〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌發(fā)生的大多數(shù)，小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)療效不佳，故本研究選取NSCLC患者為研究對象?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9可促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的形成，為腫瘤組織供給血液，對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用〔5〕。肌球蛋白重鏈(Myosin)-9是非肌肉肌球蛋白家族一員，其與細(xì)胞的多重生物學(xué)功能有關(guān)，是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，Myosin-9對NSCLC臨床病理學(xué)影響并未見系統(tǒng)研究〔6〕。富含亮氨酸重復(fù)序列G耦聯(lián)蛋白受體(LGR)4，屬于哺乳類基因中最大的蛋白超家族，原癌基因Wnt異常時(shí)，可增加LGR4蛋白表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞分裂、增殖〔7〕。本研究探討MMP-9、Myosin-9及LGR4在老年NSCLC中表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇吉林省腫瘤醫(yī)院于2019年3月至2021年3月進(jìn)行手術(shù)的老年NSCLC患者53例，平均(71.87±5.46)歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為NSCLC患者；年齡≥60歲；未進(jìn)行化療、放療及激素治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有明顯炎癥細(xì)胞浸潤癌旁組織；合并其他腫瘤者。

1.2試劑與儀器 主要試劑：兔抗人MMP-9、兔抗人Myosin-9、兔抗人LGR4(北京百奧萊博科技有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(武漢博士德公司)，SP法組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，Trizol試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)。主要儀器：光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)，移液槍(美國Thermo)，石蠟切片機(jī)(美國Thermo)，PCR儀(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3取樣 將入組患者術(shù)中切除腫瘤組織部分進(jìn)行取樣，一部分送往病理科進(jìn)行病理觀察及免疫組化染色；另一部分液氮保存用于MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白及mRNA檢測。另取入組患者經(jīng)病理證實(shí)為癌旁5 cm以上的肺組織作為對照。

1.4免疫組化法測定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白 取所有標(biāo)本以10%多聚甲醛液固定，采用石蠟包埋，以4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片，應(yīng)用二甲苯常規(guī)脫蠟，并采用酒精復(fù)水，蒸餾水沖洗；應(yīng)用蘇木素染色5 min，應(yīng)用自來水沖洗5 min；返藍(lán)15 min；再以蒸餾水沖洗，伊紅染液染色3 min；應(yīng)用自來水沖洗，鏡下觀察。石蠟切片經(jīng)烤箱烤片、常規(guī)二甲苯脫蠟，并采用不同梯度酒精水化；應(yīng)用3%H2O2室溫修復(fù)10 min，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，2 min/次；微波抗原修復(fù)，應(yīng)用PBS沖洗3 min；加入一抗放置于4℃孵育過夜，放于室溫條件下，應(yīng)用PBS沖洗3次，2 min/次；應(yīng)用DAB顯色5～10 min；脫水、透明和封片。結(jié)果判定：MMP-9、Myosin-9和LGR4主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。選取5個(gè)視野置于顯微鏡下觀察，按陽性細(xì)胞數(shù)量和顯色強(qiáng)度分級。其中以無著色為陰性(-)，以陽性細(xì)胞數(shù)25%并顯色強(qiáng)度為淡黃色為弱陽性(+)，以陽性細(xì)胞數(shù)25%～60%并顏色強(qiáng)度介于強(qiáng)陽性與弱陽性之間為中度陽性()，以陽性細(xì)胞數(shù)〉60%并多數(shù)細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色為強(qiáng)陽性()。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定MMP-9、Myosin-9和LGR4表達(dá) 采用Trizol法提取癌組織及癌旁組織總RNA，RNA濃度和純度采用分光光度計(jì)測定，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板，分別擴(kuò)增MMP-9基因、Myosin-9基因、LGR4基因和GAPDH。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。PCR條件：94℃預(yù)變形5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用2-△△Ct計(jì)算MMP-9、Myosin-9和LGR4相對表達(dá)量。

1.6Western印跡測定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液提取癌組織及癌旁組織蛋白，根據(jù)BCA法測定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。按每泳道以50 μg蛋白12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再采用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入MMP-9一抗(1∶500)、Myosin-9一抗(1∶200)和LGR4一抗(1∶500)后放置于4℃孵育過夜。應(yīng)用TBST溶液漂洗3次后，再加入二抗，室溫孵育1 h。再采用TBST洗滌3次，10 min/次。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析，內(nèi)參選GAPDH。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用Logistic多因素回歸分析NSCLC發(fā)病影響因素。

2 結(jié) 果

2.1癌組織與癌旁組織 MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)比較 癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率、mRNA表達(dá)及蛋白灰度值明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 癌組織及癌旁組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率、mRNA表達(dá)及蛋白灰度值比較

圖1 MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白在癌組織與癌旁組織中表達(dá)

2.2不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)比較 不同性別、年齡、腫瘤類型和分化程度癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)明顯比較無明顯差異(P>0.05)；Ⅲ期癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；吸煙史癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)明顯高于無吸煙史(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達(dá)比較〔n(%)〕

2.3不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白表達(dá)比較 不同性別、年齡、腫瘤類型和分化程度癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比較無明顯差異(P>0.05)；Ⅲ期癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；吸煙史癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于無吸煙史組織(P<0.05)。見表3。

表3 不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比較

2.4多因素Logistic回歸分析老年NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)因素 吸煙史、MMP-9、Myosin-9和LGR4高表達(dá)為影響老年NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析老年NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)因素

3 討 論

目前，關(guān)于NSCLC具體發(fā)病原因尚未完全明確，認(rèn)為大氣污染、吸煙、室內(nèi)燃煤、石棉暴露、高濃度砷等均可增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)〔8～10〕。由于NSCLC癥狀較為隱匿，通常就診時(shí)已屬中晚期，以此導(dǎo)致患者錯(cuò)失了最佳根治時(shí)機(jī)〔11〕。因此，及時(shí)有效地診斷和治療NSCLC方法對提高療效及預(yù)后具有重要意義。

MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)的重要調(diào)控因子，并且參與了腫瘤細(xì)胞外間質(zhì)的分解，以此促進(jìn)腫瘤的侵襲，而在腫瘤反復(fù)中侵襲性被認(rèn)為是重要因素。MMP-9是MMPs家族中重要一員，是降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的一種酶類，其成分主要為Ⅳ型膠原，而其中細(xì)胞外基質(zhì)的降解是微淋巴管生成、腫瘤微血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件。多項(xiàng)研究證實(shí)，MMP-9在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲，通過抑制MMP-9表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長并轉(zhuǎn)移的目的〔12，13〕。彭煒東等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，MMP-9表達(dá)與肺腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)，且與4年無進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān)。本研究表明，MMP-9在老年NSCLC患者中高表達(dá)；且MMP-9表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和吸煙史密切相關(guān)。

Myosin-9是非肌肉肌球蛋白家族一員，并且作為參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移、細(xì)胞骨架重建的核心成員，其作用在腫瘤中越來越受人們關(guān)注〔15〕。Myosin-9主要由2條調(diào)節(jié)輕鏈、2條必需輕鏈和2條重鏈組成的一種留聚體，在炎癥、血栓性疾病及遺傳性疾病方面發(fā)揮作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Myosin-9在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可見Myosin-9與人類各種疾病發(fā)生具有一定關(guān)系，并且認(rèn)為可能與某種腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用〔16，17〕。本研究表明，Myosin-9在老年NSCLC患者中高表達(dá)；且Myosin-9表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和吸煙史密切相關(guān)。

LGR4是G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一，稱為富含亮氨酸重復(fù)序列的GPCR4，并且為重要的一種細(xì)胞膜受體，其組成包含17個(gè)內(nèi)含子和18個(gè)外顯子，在成人和胚胎各種組織中廣泛表達(dá)，具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)器官發(fā)育、介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)與激活，在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用〔18，19〕。王春梅等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清LGR4表達(dá)高于胃良性腫瘤患者，低～中分化LGR4表達(dá)高于高分化，Ⅲ期LGR4表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LGR4表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。本研究表明，LGR4在老年NSCLC患者中高表達(dá)；且LGR4表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和吸煙史密切相關(guān)。

綜上，MMP-9、Myosin-9和LGR4在老年NSCLC中表達(dá)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和吸煙史密切相關(guān)，且為影響老年NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)因素。