張麗君， 石 皓， 姜卓言， 謝海娟， 王 林， 俞紅女

(1.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院， 遼寧 大連 116021 2.山東省曹縣市人民醫(yī)院腫瘤科， 山東 曹縣 274400)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是中國第五位常見惡性腫瘤，其病死率排惡性腫瘤第二[1]，40%～50%的結(jié)直腸癌患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。而侵襲是轉(zhuǎn)移形成最重要的一步，MMP-9是最復(fù)雜的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal proteinases，MMPs)之一，可促進(jìn)侵襲其他組織從而引起轉(zhuǎn)移[3]，因此抑制MMP-9的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)上游活性可能是一種潛在的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)佛波酯(TPA)身為一種腫瘤促進(jìn)劑，可誘導(dǎo)多種腫瘤MMP-9激活和侵襲遷移的發(fā)生[4,5]。近年來發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)可以通過與靶基因3'非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合抑制癌基因或作為腫瘤啟動子進(jìn)而參與癌癥過程[6,7]。同時可作為重要的生物調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，凋亡，癌癥進(jìn)展和腫瘤發(fā)生[8]。利用生物信息學(xué)分析顯示MMP-9在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并且與miR-122-5p存在連接位點(diǎn)。但目前關(guān)于 miR-122-5p 在結(jié)直腸癌中的研究仍然很少，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-122-5p能否靶向MMP-9逆轉(zhuǎn)TPA引起的結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并分析其潛在的作用方式。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞購買于中科院；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基分別購于上海生工BBI公司和美國Gibco公司； qPCR所用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ和SYBR Green預(yù)混型qPCR試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司；轉(zhuǎn)染所用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo試劑購自蘇州吉瑪基因；免疫印跡法所需細(xì)胞裂解液和山羊抗兔IgG抗體購自美國Thermo Fisher Scientific 公司、MMP-9抗體購自Santa Cruz 公司、GAPDH抗體購自Bioworld 公司、ECL發(fā)光試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；明膠酶譜實(shí)驗(yàn)所使用酶譜顯色緩沖液購自北京天恩澤基因科技有限公司；Transwell實(shí)驗(yàn)所需Matrigel基底膠和0.1%結(jié)晶紫染色液均購自北京索萊寶科技有限公司、Transwell小室購自美國 Corning 公司；實(shí)驗(yàn)用藥佛波酯TPA購自美國 Sigma 公司。

1.2生物信息學(xué)分析:通過GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌差異表達(dá)基因，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證差異基因在結(jié)直腸癌患者較正常的表達(dá)情況，根據(jù)差異基因結(jié)合miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) 數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶向miRNA,最后通過TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_71/) 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng):人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)在90%DMEM和10%FBS配置成的完全培養(yǎng)基，放于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后用TPA(100nM)處理不同時間(0，6，12，24h)，通過RT-qPCR和Western blot法檢測TPA對SW480細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響。細(xì)胞生長至60%～80%時利用GP-transfect-Mate對SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分組如下：陰性對照NC組、NC+TPA組、轉(zhuǎn)染miR-122-5p minics(minic組)和minic+TPA組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用含有TPA(100nM)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2RT-qPCR 檢測細(xì)胞MMP-9與miR-122-5p表達(dá)水平：采用Trizol法從處理好的SW480細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)一步使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，保存于-20℃。PCR擴(kuò)增時對cDNA稀釋5倍使用，根據(jù)SYBR Green預(yù)混型qPCR試劑盒說明書添加熒光，使用引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.3miRNA minics 轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞進(jìn)行鋪板(ρ=1.7×105/孔)，培養(yǎng)18h細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時，按照GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo試劑說明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染。置于培養(yǎng)箱中，4～6h將細(xì)胞液換成含10%FBS新鮮完全培養(yǎng)基，24h檢測mRNA表達(dá)或檢測蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染RNA oligo合成序列見表2。

表2 轉(zhuǎn)染RNA oligo 合成序列

1.3.4免疫蛋白印跡試驗(yàn)：收集所需細(xì)胞用配置好的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取蛋白，采用BCA法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)現(xiàn)蛋白定量，在保證濃度一致的前提下調(diào)整各個樣品的體積進(jìn)行蛋白變性制樣，于-80℃保存。分別配制使用了濃度10%與12%的分離膠與濃縮膠，上樣后按照電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、孵育MMP-9抗體和GAPDH抗體4℃過夜、洗膜后室溫孵育山羊抗兔IgG抗體,最后用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，結(jié)果圖像使用ImageJ軟件分析和計(jì)算灰度值。

1.3.5明膠酶譜實(shí)驗(yàn):將處理后的細(xì)胞收集并完成制樣，配制濃度10%分離膠與濃縮膠，凝固每孔上樣15ul，以60v，30min轉(zhuǎn)100v，60min完成電泳后，依據(jù)酶譜顯色緩沖液說明書孵育過夜，0.05%R-250考馬斯亮藍(lán)染色液染色，最后使用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，ImageJ軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算。

1.3.6Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移:進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)時直接將細(xì)胞懸液(ρ=2×105個/小室)放到小室；進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時取30μL Matrigel基底膠稀釋液均勻鋪滿Transwell小室，置于培養(yǎng)箱2h后更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液(ρ=3×105個/小室)加到小室。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給需要佛波酯TPA處理的組別在上下室加入TPA，使終濃度為100nM。24h后5%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色液染色，在倒置顯微鏡下觀察與拍照，最后使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況：通過GEO2R數(shù)據(jù)庫找到結(jié)直腸癌相關(guān)數(shù)據(jù)集(GSE77199、GSE141174、SGE38026)，以P<0.05，LogFC>1.0為篩選條件，進(jìn)行數(shù)據(jù)合集(如圖1A)，得到差異表達(dá)基因4個(MMP-9、PDGFRB、TGM2、UBD)。借助TCGA數(shù)據(jù)庫初步篩查發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌組織中較正常高表達(dá)(*P<0.05)，如(圖1B)。

圖1 生物信息學(xué)分析MMP-9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)A：結(jié)直腸癌差異表達(dá)Veen圖；B： MMP-9在結(jié)直腸癌中高表達(dá)注：與正常組織(N)相比，*P<0.05

2.2生物信息學(xué)篩選MMP-9的靶基因miRNA：通過GEO2R篩選結(jié)直腸癌差異表達(dá)miRNA，選取數(shù)據(jù)集GSE85589、GSE125904差異表達(dá)miRNA，按照條件(P<0.05,logFC >1.0)進(jìn)行篩選。同時，借助靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRWalk得到MMP-9存在連接位點(diǎn)(score=1.0)的miRNAs進(jìn)行合集得到其靶基因?yàn)閔as-miR-122-5p(如圖2A)。隨后，通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測兩者的連接位點(diǎn)(如圖2B)所示。

圖2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測MMP-9靶基因miRNAA：結(jié)直腸癌差異表達(dá)miRNA Veen圖; B： miR-122-5p 和 MMP-9 mRNA 3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)

2.3TPA 對結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞MMP-9 表達(dá)的影響：TPA(100nmoL /L)處理 SW480 細(xì)胞不同時間(0，6，12，24h)，利用RT-PCR 法檢測細(xì)胞中 MMP-9 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果(如圖 3)所示，TPA 誘導(dǎo) SW480 細(xì)胞 MMP-9mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，呈時間依賴性，24h 時增加最為明顯(** P<0.01)。

圖3 MMP-9 mRNA的相對表達(dá)注：與0h相比，** P<0.01

2.4TPA 對結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞miR-122-5p 表達(dá)的影響：觀察TPA(100nM) 誘導(dǎo) MMP-9 表達(dá)上調(diào)過程中對miR-122-5p 表達(dá)的影響，結(jié)果(如圖4)所示,與空白對照組相比較，TPA 處理組 miR-122-5p 表達(dá)水平明顯降低(** P<0.01)。

圖4 TPA影響SW480細(xì)胞miR-122-5p的表達(dá)注：與Control組相比，** P<0.01

2.5MiR-122-5p 對SW480 細(xì)胞MMP-9 表達(dá)的影響

2.5.1過表達(dá) miR-122-5p 的細(xì)胞模型建立 ：觀察miR-122-5p 在結(jié)直腸癌SW480 中的生物效應(yīng)，將miR-122-5p minic 及NC 在SW480 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果(如圖 5)所示，Control 組與 NC 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。miR-122-5p minic 在結(jié)直腸癌 SW480 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功(**P<0.01)。

圖5 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-122-5p minic 后 miR-122-5p 表達(dá)水平：與Control組相比，** P<0.01

2.5.2MiR-122-5p 對 TPA 誘導(dǎo) SW480 細(xì)胞 MMP-9 表達(dá)及分泌的作用 ：利用 RT-qPCR 和 Western blot進(jìn)一步觀察 miR-122-5p 對 MMP-9 的調(diào)控作用，結(jié)果(如圖 6)所示，與 NC 組相比，NC+TPA 組MMP-9表達(dá)顯著上調(diào)(**P<0.01)；與 NC+TPA 組相比,過表達(dá) miR-122-5p 的 minic+TPA 組 MMP-9 表達(dá)明顯下降(# P<0.05,##P<0.01)；明膠酶譜法結(jié)果顯示過表達(dá) miR-122-5p明顯抑制 TPA 誘導(dǎo)的 MMP-9 分泌。

圖6 MiR-122-5p 影響 TPA 誘導(dǎo) SW480 細(xì)胞 MMP-9 的表達(dá)A：MMP-9 mRNA 表達(dá)水平；B： MMP-9 蛋白表達(dá)情況及定量柱狀圖注：與NC組相比，** P<0.01；與NC+TPA組相比，A:# P<0.05，B:## P<0.01

2.6MiR-122-5p 對TPA 誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響：采用 Transwell檢測NC組、NC+TPA組、minic+TPA組和minic組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)目，觀察細(xì)胞的侵襲與遷移能力，結(jié)果(如圖7-8)所示，與NC 組相比，NC+TPA 組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著增多(**P<0.01)；與 NC+TPA 組相比，過表達(dá)miR-122-5p 的 minic+TPA 組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目明顯減少(## P<0.01)。。

圖7 各組 SW480 細(xì)胞侵襲能力及其定量分析(×200)

圖8 各組 SW480 細(xì)胞遷移能力及其定量分析(×200)注：與NC 組相比，(** P<0.01)；與 NC+TPA 組相比，(## P<0.01)

3 討 論

結(jié)直腸癌為最常見癌癥之一，研究顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是致死的主因，因此抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移的研究具有重要意義。MMP-9 是研究最廣泛的 MMP 之一，主要由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌，激活的 MMP-9影響 BMs 阻礙腫瘤細(xì)胞運(yùn)動的能力，因此在腫瘤發(fā)展過程中，基底膜的破壞是支持腫瘤侵襲和遷移的重要步驟[9]。目前文獻(xiàn)研究顯示，MMP-9 在不同惡性腫瘤中均有過表達(dá)，并且被證明與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤的進(jìn)展和侵襲有關(guān)[10]。因此，抑制 MMP-9 的過表達(dá)是防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要策略。據(jù)報(bào)道，許多刺激因子，如腫瘤壞死因子-α、成纖維細(xì)胞生長因子-2 和 TPA 均可誘導(dǎo)MMP-9 過表達(dá)[11]。佛波酯(TPA)是從巴豆油中分離出一個經(jīng)典的腫瘤促進(jìn)劑，被認(rèn)為是 PKC 依賴的多種信號通路的有效誘導(dǎo)劑，即 PKC 激活劑。蛋白激酶 C(PKC)被稱為第二種信使依賴性蛋白激酶，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，也是促腫瘤的佛波酯的受體蛋白[12]。PKC 的激活參與了癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、耐藥性和遺傳不穩(wěn)定等的發(fā)生發(fā)展[13]?；谝陨涎芯客茰yPKC激動劑TPA可通過誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。因此，本研究首先通過生物信息學(xué)分析結(jié)直腸癌組織中 MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-9 在結(jié)直腸癌中同樣存在過表達(dá)的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。同時，一系列實(shí)驗(yàn)表明TPA 可以誘導(dǎo) SW480 細(xì)胞 MMP-9 過表達(dá)與分泌，進(jìn)而有助于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

大量研究表明，MicroRNA 在多種人類惡性腫瘤中均處于表達(dá)失調(diào)狀態(tài)，并可調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[14]。其中，miR-122-5p 表達(dá)失調(diào)可以影響多種類型癌癥的 EMT、侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖或凋亡等癌癥進(jìn)展相關(guān)過程。同時，本研究實(shí)驗(yàn)也利用生物信息學(xué)分析以及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-122-5p靶向調(diào)控MMP-9 的表達(dá)進(jìn)而抑制SW480細(xì)胞的遷移侵襲能力。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中，miR-122-5p能夠靶向調(diào)控MMP-9的表達(dá)，從而抑制TPA通過激活PKC誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲遷移的能力。但是，miR-122-5p是否可以作為臨床診斷預(yù)后的標(biāo)志物，以及TPA相關(guān)抑制劑能否用于改善預(yù)后還需進(jìn)行深入研究。