劉 芝， 董麗娥， 陳 斌， 陳子鑫

(1.四川省綿竹市人民醫(yī)院， 四川 綿竹 618200 2.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科， 四川 成都 610083)

結直腸癌是發(fā)病率、死亡率分別居全球惡性腫瘤排行第三、第五的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其治療方法主要有手術、放療、化療等[1]。近年來，結直腸癌治療有了較大進展，但因當前化療藥物副作用大、腫瘤細胞易耐藥[2]，治療效果仍不令人滿意，因此，仍需要尋找治療結直腸癌的新藥物或新方法。氟伐他汀是常見的他汀類藥物，臨床主要用于治療高脂血癥。Ishikawa等[3]報道稱，氟伐他汀可能通過下調zeste同源物2介導的p27表達抑制結直腸癌細胞增殖，發(fā)揮一定抗結直腸癌作用，但其作用機制仍不明確。蛋白酪氨酸磷酸酶受體D反義RNA1(PTPRG-AS1)是一種在食管鱗癌、上皮性卵巢癌、肝癌中表達增加的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，敲減lncRNA PTPRG-AS1抑制腫瘤細胞惡性行為，可作為腫瘤治療的分子靶點[4～6]。本研究在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，lncRNA PTPRG-AS1在結直腸癌SW620細胞中表達顯著高于正常結直腸上皮FHC細胞，推測lncRNA PTPRG-AS1可能也作為促癌基因參與結直腸癌的發(fā)展進程。本研究主要探究氟伐他汀鈉和lncRNA PTPRG-AS1對結直腸癌SW620細胞增殖、凋亡的影響，并探究氟伐他汀鈉能否調控lncRNA PTPRG-AS1影響SW620細胞增殖、凋亡，以期為其用于結直腸癌的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑：正常結直腸上皮FHC細胞購自上海滬震生物科技有限公司；結直腸癌SW620細胞購自寧波明舟生物科技有限公司；氟伐他汀鈉購自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；qRT-PCR實驗相關試劑盒購自大連寶生物；RPMI 1640培養(yǎng)液、LipofectamineTM 2000試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人一抗[活化的半胱天冬酶(cleaved-caspases)-3、cleaved-caspase9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]、山羊抗兔二抗(辣根過氧化酶標記)購自英國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)：復蘇SW620、FHC細胞，均用含10 %胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測lncRNA PTPRG-AS1表達：于6孔板(1.0×105個/孔)培養(yǎng)SW620、FHC細胞24h，棄培養(yǎng)液，收集細胞。提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列：lncRNA PTPRG-AS1上游5'-AAG CCA AGC AGT CAG AAG CA-3'，下游5'-GAG CCC TGA CAG CCT AAT GA-3'；GAPDH上游5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，下游5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。2-△△Ct法計算lncRNA PTPRG-AS1相對GAPDH表達量。

1.4SW620細胞轉染和分組：于6孔板(1.0×105個/孔)培養(yǎng)SW620細胞24h，利用LipofectamineTM 2000試劑盒分別轉染si-PTPRG-AS1、si-NC、pcDNA-PTPRG-AS1、pcDNA，轉染12h后，檢測細胞中l(wèi)ncRNA PTPRG-AS1表達，驗證轉染效果。未轉染的SW620細胞分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))、氟伐他汀鈉-低、中、高組(分別用5、10、20μmoL/L[7]氟伐他汀鈉孵育)；轉染si-PTPRG-AS1、si-NC的SW620細胞處理同對照組，記為si-PTPRG-AS1組、si-NC組；轉染pcDNA-PTPRG-AS1、pcDNA的SW620細胞處理同氟伐他汀鈉高組，記為氟伐他汀鈉+pcDNA-PTPRG-AS1組、氟伐他汀鈉+pcDNA組。

1.5CCK-8法檢測細胞活性：于96孔板(5.0×104個/孔)接種未轉染、轉染后的SW620細胞并培養(yǎng)12h，然后按照上述1.4分組培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72h。加CCK-8(10μL/孔)，孵育2h，酶標儀(450 nm)測各孔吸光度(A)值。A值越大，說明細胞活性越強。

1.6克隆形成實驗：于6孔板(1.0×104個/孔)接種未轉染、轉染后的SW620細胞并培養(yǎng)12h，然后按照上述1.4分組培養(yǎng)，培養(yǎng)14d。棄培養(yǎng)液，將細胞用多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡觀察，計數(shù)。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡：于6孔板(1.0×104個/孔)接種未轉染、轉染后的SW620細胞并培養(yǎng)12h，然后按照上述1.4分組培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)液，收集各組細胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，300×g離心5min，吸棄PBS。向細胞沉淀中加Binding Buffer，重懸細胞，并調整細胞密度為1.0×106個/mL。取100μL細胞懸液，依次加10μL Annexin V-FITC、5μL PI，避光孵育15min，于1h內于流式細胞儀中檢測細胞凋亡率。

1.8Western blot法檢測蛋白表達：用RIPA裂解液提取各組細胞中總蛋白，BCA法測蛋白濃度。行SDS-PAGE實驗分離總蛋白，轉至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉封閉2h。先置于一抗[cleaved-caspase3(1∶500)、cleaved-caspase9(1∶500)、GAPDH(內參，1∶1 000)]孵育液4℃孵育12h，再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中室溫孵育1h。顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1lncRNA PTPRG-AS1在結直腸癌SW620細胞中的表達：正常結直腸上皮FHC細胞、結直腸癌SW620細胞中l(wèi)ncRNA PTPRG-AS1表達量分別為1.00±0.00、4.38±0.31，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=18.885，P<0.05)。

2.2氟伐他汀鈉對結直腸癌SW620細胞增殖的影響：氟伐他汀鈉-低、中、高組細胞活性、克隆形成數(shù)均低于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1。

表1 氟伐他汀鈉對SW620細胞增殖的影響

2.3氟伐他汀鈉對結直腸癌SW620細胞凋亡的影響：氟伐他汀鈉-低、中、高組細胞凋亡率、凋亡相關蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表達均高于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡的影響A：氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡相關蛋白表達的影響；B：氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡的影響

表2 氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡的影響

2.4氟伐他汀鈉對結直腸癌SW620細胞lncRNA PTPRG-AS1表達的影響：對照組、氟伐他汀鈉-低、中、高組lncRNA PTPRG-AS1表達量分別為1.00±0.00、0.77±0.06、0.58±0.04、0.36±0.04，四組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=131.103，P<0.05)。氟伐他汀鈉-低、中、高組lncRNA PTPRG-AS1表達量均低于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.5下調lncRNA PTPRG-AS1表達對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響：lncRNA PTPRG-AS1在轉染si-PTPRG-AS1的SW620細胞中的表達量為0.28±0.03，較轉染si-NC的SW620細胞中表達量(1.00±0.00)降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=41.569，P<0.05)，說明轉染si-PTPRG-AS1下調SW620細胞中l(wèi)ncRNA PTPRG-AS1表達。si-PTPRG-AS1組細胞活性、克隆形成數(shù)均低于si-NC組(P<0.05)，細胞凋亡率、凋亡相關蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表達均高于si-NC組(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 下調lncRNA PTPRG-AS1對SW620細胞凋亡的影響A：下調lncRNA PTPRG-AS1對SW620細胞凋亡相關蛋白表達的影響；B：下調lncRNA PTPRG-AS1對SW620細胞凋亡的影響

表3 下調lncRNA PTPRG-AS1對SW620細胞增殖和凋亡的影響

2.6上調lncRNA PTPRG-AS1表達逆轉氟伐他汀鈉(20μmoL/L)對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用：lncRNA PTPRG-AS1在轉染pcDNA-PTPRG-AS1的SW620細胞中的表達量為3.36±0.34，較轉染pcDNA的SW620細胞中表達量(1.00±0.00)升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.022，P<0.05)，說明轉染pcDNA-PTPRG-AS1上調SW620細胞中l(wèi)ncRNA PTPRG-AS1表達。氟伐他汀鈉+pcDNA-PTPRG-AS1組細胞活性、克隆形成數(shù)均高于si-NC組(P<0.05)，細胞凋亡率、凋亡相關蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表達均低于氟伐他汀鈉+pcDNA組(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 上調lncRNA PTPRG-AS1逆轉氟伐他汀鈉對SW620細胞增殖和凋亡的作用

圖3 上調lncRNA PTPRG-AS1逆轉氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡的作用A：上調lncRNA PTPRG-AS1逆轉氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡相關蛋白表達的作用；B：上調lncRNA PTPRG-AS1逆轉氟伐他汀鈉對SW620細胞凋亡的作用

3 討 論

結直腸癌發(fā)病率隨著居民飲食習慣、飲食結構的改變呈增長趨勢，嚴重危害居民生命安全。腫瘤細胞異常增殖是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因，誘導結直腸癌細胞凋亡是該腫瘤治療的主要途徑，因此，尋找抑制結直腸癌腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡的藥物，可能為結直腸癌的治療提供新途徑。

他汀類藥物可競爭性抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，且具有高度專一性，是臨床治療高血脂癥的常用藥物。近年來，體外細胞實驗顯示，他汀類藥物可抑制肺癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞的惡性行為，具有抗腫瘤作用[8,9]。氟伐他汀是他汀類藥物中的一種常見類型，其可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路阻礙皮膚鱗癌細胞增殖并促進細胞凋亡，還可通過上調SIRT6表達抑制子宮內膜癌細胞侵襲、增殖和遷移，發(fā)揮抗皮膚鱗癌、子宮內膜癌作用[7,10]。本實驗結果顯示，氟伐他汀鈉對結直腸癌細胞增殖具有顯著抑制作用，且促進細胞凋亡，與Ishikawa等[3]報道結果一致，提示氟伐他汀鈉有治療結直腸癌的潛在價值。腫瘤細胞凋亡是一種程序性死亡過程，受多種基因分子和信號通路調控。caspase9和caspase3是caspase級聯(lián)反應的重要參與者，被活化后傳遞凋亡信號，誘導細胞凋亡。本實驗結果提示，氟伐他汀鈉促進結直腸癌細胞中caspase9和caspase3活化，這也可能是其誘導結直腸癌細胞凋亡的原因之一。

lncRNA廣泛表達于真核生物中，其異常表達與結直腸癌發(fā)生發(fā)展息息相關，可作為結直腸癌治療的分子靶點[11,12]。研究顯示，lncRNA PTPRG-AS1在骨肉瘤組織和細胞中呈高表達，敲低lncRNA PTPRG-AS1對骨肉瘤細胞侵襲和遷移起抑制作用，lncRNA PTPRG-AS1可作為骨肉瘤治療的分子靶點[13]；lncRNA PTPRG-AS1在鼻咽癌細胞中表達上調，其通過發(fā)揮miR-194-3p“海綿”作用上調PRC1表達，進而促進鼻咽癌細胞侵襲、遷移、增殖及放療抗性，敲減lncRNA PTPRG-AS1可能改善鼻咽癌治療效果[14]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，lncRNA PTPRG-AS1在結直腸癌細胞中表達升高，下調lncRNA PTPRG-AS1抑制結直腸癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡，與lncRNA PTPRG-AS1對骨肉瘤、鼻咽癌細胞惡性行為的影響一致，提示lncRNA PTPRG-AS1作為促癌因子參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，下調lncRNA PTPRG-AS1有利于減緩結直腸癌的發(fā)展進程。本研究還顯示，氟伐他汀鈉呈劑量依賴性抑制結直腸癌細胞中l(wèi)ncRNA PTPRG-AS1表達，而上調lncRNA PTPRG-AS1逆轉了氟伐他汀鈉對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響，提示氟伐他汀鈉可能通過下調lncRNA PTPRG-AS1發(fā)揮抗結直腸癌作用。

綜上，氟伐他汀鈉抑制結直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，具有抗結直腸癌作用，其作用機制可能與下調lncRNA PTPRG-AS1表達有關。但是，lncRNA通常發(fā)揮miRNA“海綿”作用影響靶基因表達，進而發(fā)揮生物學調控功能，因此，氟伐他汀鈉作用的lncRNA PTPRG-AS1下游miRNA和靶基因還有待探究；同時，本研究尚未在體內探究氟伐他汀鈉抗結直腸癌的作用，這是本文的不足之處，也是接下來要進行的研究內容。