李 鵬， 歐陽運(yùn)萍， 陳 濤， 趙 博, 楊小軍

(河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院， 河北 唐山 063000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI) 急性肺損傷是因多種的疾病導(dǎo)致的肺部的損傷，可能會導(dǎo)致呼吸窘迫綜合癥，還會出現(xiàn)多器官的功能的障礙綜合癥，也是一種比較常見的慢性的疾病[1]。根據(jù)1994年歐美聯(lián)席會議提出的ALI診斷標(biāo)準(zhǔn),在發(fā)達(dá)國家ARDS發(fā)病率分別在每年79/10萬和59/10萬，病因不同ALI發(fā)病率也不同[2]。Rspondin 3 (RSPO3; Cristin 1) 是一種分泌型Wnt調(diào)節(jié)蛋白，在發(fā)育中的心臟的頂板、中胚層、動脈干、房室管中表達(dá)，也在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3～5]，但是其在急性肺損傷中的作用機(jī)制尚不清晰。Wnt 信號通路參肺部發(fā)育、體內(nèi)平衡、損傷后的再生、體外定向分化，但是在急性肺損傷中的作用尚不清晰[6,7]，但是Wnt-3a信號通路是否受到Rspondin 3調(diào)控在急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用尚不清晰。因此本研究擬通過建立大鼠急性肺損傷模型，探究Rspondin3對大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，及對wnt信號通路的調(diào)控機(jī)制，為臨床Rspondin3在急性肺損傷中發(fā)揮的調(diào)控作用提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

1.1.1SD大鼠:60 只8-10周齡雄性SPF級SD大鼠220g±20g，購于北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司(SYXK(京)2020-0047)。大鼠飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，相對濕度(50±5)% ，噪音60 分貝 以下 ，通風(fēng)換氣8 次/h。本實驗通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2藥品與試劑:戊巴比妥鈉購自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；蘇木精(H9627)、伊紅(H9627)，大鼠 IL-1 ELISA 試劑盒(RAB0272)、大鼠 IL-2 ELISA 試劑盒(RAB0311)，大鼠 IL-6 ELISA 試劑盒RAB0246購于美國sigma公司；引物，Rspondin3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒購于上海生工有限公司。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于日本TAKARA有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備:4℃及-80℃低溫冰箱購自海爾股份有限公司，CGF-300A低速離心機(jī)，購自湖南湘銳有限公司，包埋機(jī)、切片機(jī)等購于德國萊卡有限公司，MDpectraMax190酶標(biāo)儀購于美國賽默飛公司，western blot電泳儀購于美國BD公司。透射電鏡JEM-1230 德國JEOL公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠分組及給藥方式:大鼠自由攝取食物和飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，除對照組外，各組以 10mg/kg LPS腹腔注射誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型。模后2h大鼠后逐漸出現(xiàn)高熱，呼吸急促等表現(xiàn)即為造模成功。對照組給與等量生理鹽水。造模后各組大鼠在造模后隨機(jī)分為3組，模型組、NC組和Rspondin3組，尾靜脈注射NC質(zhì)粒和Rspondin3質(zhì)粒，對照組和模型組給與等量生理鹽水，1周后對各組大鼠進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2.2HE染色:采用脫頸法處死大鼠分離肺組織，置入 10%甲醛液中固定48h,持續(xù)流水沖洗1h，包埋后用石蠟切片機(jī)切4μm厚度切片，60℃烘箱5min；二甲苯Ⅰ 脫蠟20min，二甲苯Ⅱ 脫蠟10min，梯度乙醇各1min；蘇木素染色5min，伊紅染色1min；依次運(yùn)用不用濃度的50%～70%～80%乙醇脫水1min，再用95%乙醇漂色1min，無水乙醇脫水5min，最后放入二甲苯Ⅰ3min，二甲苯Ⅱ3min；中性樹膠封片后顯微鏡下進(jìn)行觀察[11]。

1.2.3ELISA檢測肺組織炎癥因子表達(dá):大鼠經(jīng)腹腔麻醉后,眼眶采肺組織1～1.5mL,4℃ 3000 r/ min,離心 10min,收集上清液,分裝到 EP 管中,嚴(yán)格按照試劑盒說明采用ELISA檢測肺組織清中IL-1、IL-2、IL-6表達(dá)水平，于吸光度450nm下進(jìn)行各樣本吸光度檢測[12]。

1.2.4Western blot檢測巨噬細(xì)胞 Wnt-3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平:液氮研磨各組大鼠肺組織，加入RIPA提取裂解液制成蛋白提取液，使用BCA法測定蛋白濃度，將樣品分別加入不同的泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V,5%BSA封閉。分別加入特異性一抗Anti-Wnt-3a antibody (ab101408) (1∶3000,abcam，英國)，Anti-IKB alpha antibody[E130] (ab32518) (1∶ 1/100000，abcam，英國)，Anti-GAPDH antibody(1∶10000，ab8245，abcam，英國)于4℃冰箱過夜。加入特異性的二抗(1∶2000)，孵育1h[13]。采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.5透射電鏡檢測過表達(dá)各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu):將肺組織準(zhǔn)備為小于1mm3組織塊，依次通過固定、脫水，包埋，固化，37℃烘箱內(nèi)過夜，45℃烘箱內(nèi)12h，60℃烘箱內(nèi)48h，超薄切片機(jī)切片70nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡JEOL JEM-1230(80KV)觀察。拍片。

2 結(jié) 果

2.1Rspondin3干預(yù)對急性肺損傷大鼠病理影響:采用HE染色確定過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺組織病理狀態(tài)的影響，見圖1,對照組細(xì)胞形態(tài)完整，不存在肺組織血管增生，而模型組和NC組可見明顯的組織結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，有較多的炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列不整齊，組織間隙明顯；過表達(dá)Rspondin3組可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，并伴有局部的炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列不整齊，但總體組織損傷程度低于NC組和模型組。

圖1 過表達(dá) Rspondin3對大鼠肺部病理損傷學(xué)的影響

2.2Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺組織清IL-1、IL-2和IL-6表達(dá)水平的影響:通過ELISA實驗探究過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺組織IL-1、IL-2和IL-6表達(dá)水平影響，見表1，結(jié)果表明與對照組相比，模型組、NC組、Rspondin3組、大鼠肺組織清IL-1、 IL-2和 IL-6表達(dá)水平顯著升高，與模型組相比和NC組相比，Rspondin3組IL-1、 IL-2和IL-6表達(dá)水平顯著降低，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠肺組織炎癥因子表達(dá)比較

2.3過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表達(dá)的影響:通過weshtern blot實驗探究過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺部組織 Wnt-3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明與對照組相比，模型組、NC組Wnt-3a蛋白β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組相比和NC組相比，Rspondin3組 Wnt-3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 Rspondin3對急性肺損傷大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表達(dá)的影響

圖2 Rspondin3對急性肺損傷大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表達(dá)的影響

2.4過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)影響:采用透射電鏡明確過表達(dá)Rspondin3對急性肺損傷大鼠肺組織精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響，如圖3所示,對照組組肺組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核胞核形態(tài)正常，模型組和NC組組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為紊亂，細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞水腫，并伴有空泡化現(xiàn)象。Rspondin3組組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)相對清晰、完整，細(xì)胞腫脹程度較輕，細(xì)胞器邊界相對清晰，結(jié)構(gòu)相對較為完整。

圖3 過表達(dá)Rspondin3對大鼠急性肺損傷組織超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)可由各種疾病和情況引起，包括敗血癥、肺炎、創(chuàng)傷、急性胰腺炎、吸入胃內(nèi)容物、接近溺水等造成[8]。當(dāng)前ALI雖然已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但可行的預(yù)測性分子生物標(biāo)志物和基于分子機(jī)制仍然有待揭示[9]。R-Spondins 是血小板反應(yīng)蛋白的成員1型重復(fù)超基因家族[10]，在許多組織中廣泛表達(dá)，可作為β-連環(huán)蛋白信號級聯(lián)的激活劑發(fā)揮作用，導(dǎo)致TCF 依賴的基因激活，并且可以通過與Wnt拮抗劑DKK-1 競爭與Wnt共受體LRP-6和Kremen的結(jié)合來調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin，但其在急性肺損傷中的作用研究較少[11]。因此本研究通過建立大鼠急性肺損傷模型探究Rspondin3過表達(dá)后對急性肺損傷后大鼠保護(hù)作用的機(jī)制，通過HE染色發(fā)現(xiàn)Rspondin3組大鼠肺部組織炎性細(xì)胞浸潤降低，病理損傷降低，尤其是炎性細(xì)胞的數(shù)量降低，提示炎性組織損傷減少，結(jié)合本研究Elisa的結(jié)果，過表達(dá)Rspondin3后大鼠IL-1、IL-2，IL-6表達(dá)水平顯著降低，證實此過程伴隨著炎癥反應(yīng)的抑制，由此推測Rspondin3可能通過調(diào)控白介素家族分子一致炎癥反映過程，結(jié)合病理結(jié)果提示Rspondin3可能通過降低炎癥因子釋放，本研究推測其可以發(fā)揮急性肺損傷過程中的炎癥反應(yīng)，改變肺部組織炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)，降低肺組織由于IL-1、IL-2，IL-6造成的炎性損傷，發(fā)揮肺組織實質(zhì)的保護(hù)作用。

Wnt-3a Wnt信號通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，其功能最常見于胚胎發(fā)育和癌癥，但也參與成年動物的正常生理過程，研究表明WNT 信號驅(qū)動的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移[12,13]，但是是否參與到急性肺損傷過程尚不清晰，因此本研究通過Western blot證實在急性肺損傷過程肺組織中 Wnt-3a信號通路的激活受到了顯著的抑制，β-catenin的表達(dá)也顯著降低，而過表達(dá)Rspondin3表達(dá)顯著上調(diào)，同時結(jié)合本文肺組織漿中Elisa對炎癥因子IL-1、IL-2和IL-6的抑制作用，提示出Rspondin3可能通過抑制白介素的釋放，激活Wnt-3a信號通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗炎的肺部保護(hù)作用。為了準(zhǔn)確炎癥本研究的推論，因此本研究最后通過透射電鏡實驗驗證了對肺組織的超微結(jié)構(gòu)影響，結(jié)果證實過表達(dá)Rspondin3肺組織細(xì)胞損傷降低，細(xì)胞核崩解有顯著緩解，證實了Rspondin3可以通過保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)揮肺組織的保護(hù)作用。

綜上本研究表明Rspondin3對大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與 Wnt-3a/β-catenin信號通路的激活有關(guān)，本研究可以進(jìn)一步通過臨床試探究患者中Rspondin3表達(dá)水平，為臨床診斷提供分子理論基礎(chǔ)。