吳剛強， 袁春云， 袁思斯， 毛 葉， 陳 琪，溫小鳳， 譚 軍， 卜獻春

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院老干科/全國名老中醫(yī)藥專家卜獻春傳承工作室, 湖南 長沙 410006 2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科, 湖南 長沙 410006 3.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科, 湖南 長沙 410005)

糖尿病是目前全人類需要共同面對的一個重大健康問題。糖尿病心肌病以糖尿病患者的心肌細胞壞死和凋亡為特征。研究顯示，糖尿病會引起心臟自噬抑制，其在糖尿病心肌病的發(fā)病機制中占有一席之地，而增強自噬能在糖尿病心肌病中形成保護心臟的作用，減少心臟組織細胞凋亡，改善心臟損傷[1]。近年來PI3K-Akt-mTOR信號通路被認為是自噬調(diào)節(jié)中唯一的抑制性通路，在自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究顯示，調(diào)節(jié)PI3K-Akt-mTOR信號通路可激活自噬，減輕心肌損傷[2]。因此，PI3K/Akt/mTOR-自噬作為一種關鍵性的自我調(diào)節(jié)機制對糖尿病心肌細胞凋亡起著極其重要的作用。雖然越來越多的藥物被循證醫(yī)學證明治療糖尿病心肌病療效顯著，但糖尿病心肌病的高發(fā)病率和高死亡率仍然困擾著廣大臨床醫(yī)務工作者。中醫(yī)藥治療糖尿病療效確切，具有毒副作用小，價格低廉，患者依從性好。課題組根據(jù)前期臨床與實驗研究表明，應用益氣養(yǎng)陰、活血通絡的滋膵通脈飲治療糖尿病心肌病取得了令人滿意的結(jié)果[3,4]。本研究結(jié)合課題組前期開展的研究，擬從PI3K-Akt-mTOR信號通路的角度，探究滋膵通脈飲含藥血漿對高糖誘導下的心肌細胞自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑與主要儀器:LC3-Ⅱ抗體(貨號：18725-1-AP，美國proteintech)，PI3K 抗體(貨號：bs-0128R，博奧森),P-Akt 抗體(貨號：66444-1-Ig，美國proteintech),mTOR(貨號：bs-1992R，博奧森),caspase-3抗體(貨號：ab184787，英國abcam)，GAPDH抗體(貨號：10494-1-AP，美國proteintech)，HRP goat anti-mouse IgG抗體(貨號：SA00001-1，美國proteintech)，HRP goat anti-rabbit IgG抗體(貨號：SA00001-2，美國proteintech)，1.0moL/L Tris·HCl(pH6.8)(貨號：AWB0074，中國abiowell)，10%APS(貨號：AWB0093，中國abiowell)，10%SDS(貨號：AWT0047，中國abiowell)，TEMED(貨號：AWB0068，中國abiowell)，PBST 緩沖液(貨號：AWI0130，中國abiowell)，30%Acr/Bic(貨號：AWB0020，中國abiowell)，電泳液緩沖液(貨號：AWB0083，中國abiowell)，RIPA裂解液(貨號：AWB0136，中國abiowell)，蛋白酶抑制劑(貨號：583794，中國北京金泰宏達)，蛋白磷酸酶抑制劑(貨號：AWH0650，中國abiowell)，胰酶消化液(貨號：AWC0232，abiowell)，胎牛血清(FBS)(貨號：10099141，Gibco)，細胞凍存液(貨號：AWC0229，abiowell)，凋亡試劑盒(APC)(貨號：KGA1030，凱基生物)，Rapamycin(貨號：A8167，ApexBio)，搖床(貨號：TS-92，其林貝爾)，顯微鏡(貨號：BA210T，Motic)。

1.2制備含藥血漿:20只SD大鼠，隨機分為兩組，空白血漿組、滋膵通脈飲組，每組10只。按臨床上5倍成人(70kg)劑量給藥。滋膵通脈飲主要由黃芪、生地黃、山茱萸、玄參、天花粉、麥冬、生蒲黃、全蝎、水蛭、地龍、僵蠶、丹參、山楂、川芎、鬼箭羽等藥物組成，以上藥材均從湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房購得。藥物濃度為4.4g/mL，灌胃量為10mL·kg-1·d-1；空白血漿組采用等劑量的滅菌超純水灌胃(給藥體積為10mL/kg)。連續(xù)灌胃7d，所有大鼠采血前12h禁食不禁水，最后一次灌胃1h后麻醉，進行腹主動脈采血，用1.5%的EDTA-Na2對采得的血液進行抗凝處理后，離心取血漿，首先使用0.22μm濾膜過濾血漿，然后在56℃恒溫水浴鍋中對其滅活30min，最后分裝至無菌EP管中，放置在-80℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3CCK-8法篩選含藥血漿濃度:把接種在細胞培養(yǎng)板(96孔)上的生長狀態(tài)良好的H9c2心肌細胞分為正常組、空白血漿組和含藥血漿組。正常組用完全培養(yǎng)液，各組分別設10個復孔，加入細胞懸液(100μL/孔)。把以上各組放入恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中過夜進行預培養(yǎng)處理后，分別加入胎牛血清，空白血漿和含藥血漿，每組均設置5%、10%、15%的濃度梯度。均置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)24h。經(jīng)培養(yǎng)后，各孔中滴加10μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2h，檢測各孔在450nm處的OD值。

1.4細胞培養(yǎng)和處理:H9c2細胞培養(yǎng)于含10%FBS+1%雙抗的DMEM中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長的細胞鋪板在96孔板里面，待細胞貼壁后分為A(正常組)、B(模型組)、C(模型+中藥含藥血漿組)、E(模型+恩格列凈組)。正常組：細胞正常培養(yǎng)；模型組：細胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+ 15%的空白血漿；模型+滋膵通脈飲含藥血漿組：細胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+10%含中藥含藥血漿；模型+恩格列凈組：細胞加33.3mmoL/L的 D-葡萄糖+0.01umoL/L恩格列凈，培養(yǎng)24h后收集細胞。

1.5免疫熒光染色(IF)檢測LC3B在H9C2心肌細胞的表達:取出細胞爬片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次；加入0.3%曲拉通，37℃、30min進行細胞膜通透，PBS漂洗3次；用5%BSA、37℃封閉60min，PBS沖洗3次；滴加經(jīng)過適當稀釋的一抗(LC3B)4℃過夜進行一抗的孵育，PBS沖洗3次；再滴加50～100μL抗-Rabbit-IgG標記熒光抗體，37℃孵育90min完成二抗的孵育，PBS漂洗3次；使用DAPI工作液37℃、10min進行復染核，PBS沖洗3次；緩沖甘油封片(注意避光保存)。利用熒光顯微鏡實施觀察分析及采集圖像。

1.6免疫印跡(Western Blot)法檢測H9c2心肌細胞中PI3K、P-Akt、mTOR、caspase-3的蛋白表達:蛋白提?。孩儆帽A冷PBS洗滌細胞一次，加入200μL RIPA裂解液，用細胞刮刀刮下細胞，收集懸液，超聲破碎1.5min；②冰上，裂解10min；③4℃，12000 rpm離心 15min；④將離心后的上清轉(zhuǎn)移倒 1.5mL的離心管中。蛋白濃度檢測：①根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50：1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。②完全溶解蛋白標準品，濃度為2mg/mL。標準品用RIPA裂解液按照50%梯度稀釋。③將各梯度稀釋標準品和空白樣每樣25μL加到96孔板的標準品孔中。④將25μL的樣品加入到96孔板的樣品孔中。⑤將200μL BCA工作液加入到各孔中，37℃溫度下放置30min。在550 nm波長出測定吸光值。根據(jù)標準曲線水平計算蛋白的濃度。Western Blot：①制膠：a制備10%的分離膠，加入 TEMED后搖勻,后即可灌膠。灌膠后，再用異丙醇封膠；b當微微傾斜制膠器分界線不再變化時，說明膠已凝了。再等 3min 左右,當膠充分凝固后,去除膠上層異丙醇,并用濾紙充分吸干。C制備4.8%的濃縮膠，加入 TEMED后充分搖勻,后即可進行灌膠。將梳子插入到玻璃板中，剩余的空間即可灌滿濃縮膠，待膠凝固后即可。②樣品準備：取100μL蛋白上清，加入25μL 5*loading buffer混勻，沸水煮5min，放入冰盒中速冷備用。③電泳：a根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，再第一個孔點加入marker 2μL，其余每孔加入10～20μL已變性的蛋白。b開始電泳，電泳恒定電壓75V，時間為130min。待溴酚藍電泳至膠底部時即可終止電泳。④轉(zhuǎn)膜：a按照切全膜。b準備6張大小與膠相同的濾紙和1張NC膜，NC膜與濾紙一同放入到轉(zhuǎn)膜緩沖液中，使其完全浸透。c按照濾紙，NC膜，膠，濾紙的順序依次放好，中間排除氣泡。d蓋上儀器，接通電源，300mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，各指標轉(zhuǎn)膜時間見抗體信息。d轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入PBST中清洗1次。⑤封閉：用1*PBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置90min；⑥一抗孵育：a用PBST將一抗按照一定比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，4℃過夜，次日室溫放置30min；b孵育結(jié)束，1*PBST洗3次，每次10min。⑦二抗孵育：a用1*PBST稀釋HRP標記的二抗(具體比列見下表)，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90min；b孵育結(jié)束，1*PBST清洗3次，每次大約15min。⑧顯色/曝光：ECL顯色曝光：使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，凝膠系統(tǒng)成像。

1.7統(tǒng)計學處理:利用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件處理相關的數(shù)據(jù)。多組比較用one-way ANOVA分析，顯著性水平α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的滋膵通脈飲含藥血漿對H9c2心肌細胞的影響:運用CCK-8法檢測滋膵通脈飲含藥血漿對H9c2心肌細胞增殖的影響，結(jié)果顯示：同正常組比較，濃度為10%的滋膵通脈飲含藥血漿及空白血漿組OD值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.1910，P=0.8513，t=0.3907，P=0.7019)，其對細胞增殖抑制的影響最小。當采用5%、15%濃度的滋膵通脈飲含藥血漿進行干預時，細胞增殖受抑制，各組OD值較正常組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.2605，P=0.0402，t=2.6247，P=0.0199)，故選用10%作為最佳含藥血漿的干預濃度。見表1。

表1 不同濃度的滋膵通脈飲含藥血漿對H9c2心肌細胞增殖的影響

2.2滋膵通脈飲含藥血漿對H9c2心肌細胞自噬標志物LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表達的影響:與正常組比較，模型組LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表達明顯降低；與模型組比較，滋膵通脈飲組與恩格列凈組LC3B Ⅱ/LC3BⅠ的表達明顯升高(P<0.05)；滋膵通脈飲組與恩格列凈組LC3B Ⅱ/LC3BⅠ的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組H9c2心肌細胞自噬標志物LC3B Ⅱ/LC3BⅠ表達的比較

2.3滋膵通脈飲含藥血漿對PI3K-Akt-mTOR 信號通路和凋亡蛋白的影響 與正常組比較，模型組PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表達明顯升高；與模型組比較，滋膵通脈飲含藥血漿組與恩格列凈組PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表達明顯降低(P<0.05)；滋膵通脈飲含藥血漿組與恩格列凈組PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 滋膵通脈飲含藥血漿對PI3K-Akt-mTOR信號通路和凋亡蛋白的影響

3 討 論

糖尿病屬于以慢性高血糖為特點的代謝紊亂疾病之一，近年來其發(fā)病率激增。糖尿病心肌病是糖尿病常見的并發(fā)癥，氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞外基質(zhì)蛋白和晚期糖基化產(chǎn)物的堆積是糖尿病心肌病的早期特征。隨著病情的進一步發(fā)展，逐步出現(xiàn)左心室肥厚和收縮功能不全，最后導致心衰的發(fā)生。糖尿病心肌病的病理特征表現(xiàn)為心肌細胞的變性壞死、細胞凋亡。自噬在維持心臟功能和結(jié)構(gòu)，以及維護心肌細胞的完整性有不可估量的作用。適度的自噬對心臟的健康尤其重要。研究顯示[5]，自噬紊亂與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關，恢復正常的自噬水平對糖尿病心肌病有明顯的保護作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路在多類細胞中廣泛存在，經(jīng)調(diào)理細胞能量代謝和周期等多種渠道施展非常重要的生理功能。PI3K是存在于體內(nèi)的一種重要蛋白，許多生命活動的發(fā)生與發(fā)展都需要其介入。當細胞膜接受信號因子的指令后可激活PI3K，被激活的PI3K誘導質(zhì)膜上的第二信使PIP3活化，Akt蛋白的Thr308位點可被PIP3磷酸化，進而激活Akt。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞的生長、增殖和存活。Akt從細胞漿轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，同時產(chǎn)生磷酸化，Akt活化后可通過激活下游蛋白-mTOR來調(diào)控胞內(nèi)的凋亡及自噬。近年來PI3K-Akt-mTOR信號通路被認為是自噬調(diào)節(jié)中唯一的抑制性通路，在心肌細胞自噬調(diào)控中起著非常重要的作用[6]。激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制自噬的產(chǎn)生[7]。研究顯示，芪藶強心膠囊可以通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR通路，激活自噬，抑制細胞凋亡，減輕心肌損傷[8]。麥冬皂苷可以促進2型糖尿病大鼠心肌細胞自噬，使其心臟功能得到改善，其機制或許和抑制Akt/mTOR通路相關[9]。本研究顯示，高糖刺激下的H9c2心肌細胞PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表達明顯升高，而藥物干預后恩格列凈組和滋膵通脈飲含藥血漿組PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表達明顯下降，說明高糖刺激后H9c2心肌細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，從而抑制了自噬，出現(xiàn)了自噬障礙。而藥物干預后PI3K/Akt/mTOR信號通路被抑制，自噬被激活，自噬小體也隨之減少，減輕了心肌細胞損傷。

LC3蛋白作為一種自噬標志物，是自噬小體的標志蛋白，可分為 LC3-I和 LC3-Ⅱ 2種形式，一般用LC3-Ⅱ/ LC3-I的比值和p62的表達水平來評價細胞自噬。LC3-Ⅱ/ LC3-I 比值越高，說明自噬活性越強[10]。Caspase-3是細胞凋亡相關的關鍵蛋白[11]，當發(fā)生細胞凋亡時，促凋亡基因釋放增多，導致細胞色素C進入細胞線粒體中，從而活化Caspase-3，被激活的Caspase-3可通過激活核因子、DNA裂解酶等一系列的途徑破壞細胞內(nèi)多種蛋白酶復合體，從而導致細胞凋亡的發(fā)生[12]。本研究顯示，高糖刺激下的H9c2心肌細胞LC3B Ⅱ/LC3BⅠ明顯下降，凋亡相關蛋Caspase-3表達明顯升高，說明自噬障礙加重了心肌細胞損傷，加快了心肌細胞凋亡,而藥物干預后恩格列凈組和滋膵通脈飲含藥血漿組LC3B Ⅱ/LC3BⅠ明顯上升，凋亡相關蛋白Caspase-3表達明顯下降,說明激活自噬可減輕心肌細胞凋亡。這也許同抑制PI3K/P-Akt/mTOR信號通路，激活心肌細胞的自噬相關。

本研究采用湖南省名中醫(yī)卜獻春教授的中藥復方滋膵通脈飲對高糖誘導的心肌細胞進行干預，旨在模擬糖尿病心肌病的模型，結(jié)果顯示，滋膵通脈飲可通過抑制PI3K/P-Akt/mTOR信號通路，激活心肌細胞自噬而減少心肌細胞凋亡蛋白的表達而抑制心肌細胞凋亡。滋膵飲出自于《醫(yī)學衷中參西錄》，原方由黃芪、生地、山藥、生豬胰等組成，主要用于治療消渴。卜獻春教授之滋膵通脈飲系在原方基礎上加減而成，方中丹參、川芎、生蒲黃、地龍、水蛭、鬼箭羽活血化瘀，輔以黃芪益氣升陽，助主藥活血通絡；生地、麥冬、玄參、山茱萸、天花粉滋養(yǎng)五臟之陰，生津潤燥，佐以僵蠶、全蝎熄風通絡，山楂消食活血，同時防止滋陰活血藥物礙胃。全方具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡之效。本方加用了增液湯(生地、麥冬、玄參)，研究顯示[13]，增液湯可以通過激活Akt1，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，促進胰島素的分泌、改善胰島功能。研究顯示[14]，黃芪的主要作用成分黃芪甲苷可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌氧化應激和炎癥反應，減輕心肌細胞凋亡。地龍?zhí)崛∥镌诮档吞悄虿⌒募〔〈笫笱堑耐瑫r，還能減輕心肌纖維化，改善心功能[15]。該研究從體外實驗再次證明，滋膵通脈飲可激活心肌細胞自噬而抑制心肌細胞凋亡，這可能與抑制PI3K/P-Akt/mTOR信號通路有關。