劉桂霞， 鄧科蘭， 厲銀平

(湖北省孝感市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 湖北 孝感 432099)

肺癌是發(fā)病率與死亡率較高的腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類型，約占所有肺癌的80%。目前，NSCLC治療手段包括手術(shù)治療、化療、靶向治療、免疫治療等，多數(shù)患者確診時(shí)已至晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率較低。因此，研究NSCLC的發(fā)病機(jī)制，探索新的治療靶點(diǎn)，對于改善預(yù)后具有重要意義[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理活性中發(fā)揮重要作用，lncRNAs的異常表達(dá)與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病密切相關(guān)[2]。lncRNA MNX1-AS1是位于第7號(hào)染色體上的lncRNA，據(jù)報(bào)道顯示，lncRNA MNX1-AS1在卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達(dá)水平升高，通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)等過程，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3]。研究顯示[4]，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC組織中表達(dá)水平升高，與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，但lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究分析lncRNA MNX1-AS1在NSCLC組織中的表達(dá)，探討lncRNA MNX1-AS1在NSCLC細(xì)胞中的生物學(xué)功能及可能的作用機(jī)制，以期為NSCLC的診治提供思路。

1 材料與方法

1.1材料:選取2017年6月至2019年3月期間在本院進(jìn)行手術(shù)治療的75例NSCLC患者的癌組織及癌旁正常組織，-80℃保存，該研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)及NSCLC細(xì)胞系(H1299、H2170、A549、PC-9)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI 1640購自美國Invitrogen公司；攜帶干擾lncRNA MNX1-AS1表達(dá)質(zhì)粒(si-MNX1-AS1)、其陰性對照質(zhì)粒(si-NC)及引物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT試劑盒購自北京索萊寶公司；Omniscript RT Kit及miScript SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen；ECL試劑、TRIzol試劑、Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑(C0526)、兔抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR)抗體購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組:將BEAS-2B、H1299、H2170、A549、PC-9細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清及雙抗)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%左右時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將PC-9細(xì)胞分為對照組(Control)、si-MNX1-AS1組、si-NC組，使用Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑對PC-9細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對照組不做轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染48h后qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2RT-qPCR檢測lncRNA MNX1-AS1:采用RT-qPCR檢測NSCLC癌組織、癌旁正常組織及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1表達(dá)，Trizol試劑提取總RNA，使用Omniscript RT Kit合成cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，lncRNA MNX1-AS1上游引物(5′-3′)：CACCAACGGGGAGTGGATAC，下游引物(5′-3′)：CTCCAGGGACCAACCAAGTC；GAPDH上游引物(5′-3′)：AGTCCACTGGCGTCTTCA，下游引物(5′-3′)：GAGTCCTTCCACGATACCAA，采用2-△△Ct法分別計(jì)算lncRNA MNX1-AS1表達(dá)量。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后的各組PC-9細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別于24、48、72h時(shí)每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，孵育4h后，加入150μL的DMSO溶液終止反應(yīng)，檢測吸光度值A(chǔ)490nm，繪制生長曲線。

1.2.4EdU實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期的各組PC-9細(xì)胞以4×104/孔接種于96孔板中，每孔加入100μL的EdU染色液(使用培養(yǎng)液稀釋濃度為50μM)孵育2h，4%甲醛溶液室溫固定30min，再加入0.5% TritonX-100透化10min，Hoechest復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5Transwell小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲:用無血清培養(yǎng)液PC-9細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為4×105個(gè)/mL，上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加600μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24h，多聚甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察細(xì)胞遷移數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)使用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell上室，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn):收集各組細(xì)胞，加入適量RIPA裂解，BCA法檢測蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2h，分別加入p-PI3K(1∶1500稀釋)、PI3K(1∶1000稀釋)、p-AKT(1∶1000稀釋)、AKT(1∶1500稀釋)、p-mTOR(1∶1000稀釋)、mTOR(1∶1000稀釋)和GAPDH(1∶1000稀釋)抗體，4℃過夜后，加二抗(1∶1000)孵育2h，ECL試劑顯影，分析條帶蛋白相對表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS25.0、Graph Pad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用n(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表達(dá):與癌旁組織比較，NSCLC組織中l(wèi)ncRNA MNX1-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表達(dá)

2.2lncRNA MNX1-AS1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系:根據(jù)lncRNA MNX1-AS1在NSCLC組織中表達(dá)水平中位值，將NSCLC患者分為lncRNA MNX1-AS1高表達(dá)組(≥2.36)38例和lncRNA MNX1-AS1低表達(dá)組(<2.36)37例，分析發(fā)現(xiàn)lncRNA MNX1-AS1表達(dá)與TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 lncRNA MNX1-AS1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3lncRNA MNX1-AS1與NSCLC患者預(yù)后相關(guān)性:Kaplan-Meier生存分析顯示，lncRNA MNX1-AS1高表達(dá)組患者3年累積生存率為42.11%(16/38)，顯著低于低表達(dá)組的81.08%(30/37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.132，P=0.001)，見圖1。

圖1 lncRNA MNX1-AS1表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系

2.4lncRNA MNX1-AS1在NSCLC細(xì)胞系中表達(dá):與BEAS-2B比較，lncRNA MNX1-AS1在H1299、H2170、A549、PC-9細(xì)胞中表達(dá)水平升高(P<0.05)，見表3，在PC-9細(xì)胞中表達(dá)水平最高，選擇PC-9細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 lncRNA MNX1-AS1 在NSCLC細(xì)胞系中表達(dá)

2.5lncRNA MNX1-AS1對PC-9增殖的影響:與Control組和si-NC組比較，si-MNX1-AS1組PC-9細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，EdU染色結(jié)果顯示，si-MNX1-AS1組EdU陽性細(xì)胞數(shù)較Control組和si-NC組減少，見圖2、3，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表達(dá)顯著抑制PC-9細(xì)胞增殖。

圖2 各組PC-9細(xì)胞生長曲線注：與Control組比較，#P<0.05；與si-NC比較，*P<0.05

圖3 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖(×40)

2.6lncRNA MNX1-AS1對PC-9細(xì)胞遷移與侵襲的影響:與Control組和si-NC組比較，si-MNX1-AS1組PC-9細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表達(dá)可顯著抑制PC-9細(xì)胞遷移與侵襲。見圖4、表4。

圖4 各組PC-9細(xì)胞遷與移侵襲圖片(×100)

表4 各組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)比較

2.7lncRNA MNX1-AS1對PC-9細(xì)胞PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響:與Control組和si-NC組比較，si-MNX1-AS1組PC-9細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，表明抑制lncRNA MNX1-AS1表達(dá)可顯著抑制PI3K/AKT通路的激活，見圖5、表5。

圖5 western blot檢測各組PC-9細(xì)胞蛋白表達(dá)A：Control組；B：si-NC組；C：si-MNX1-AS1組

表5 各組細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

NSCLC是一種死亡率極高的惡性腫瘤，其早期診斷困難，晚期患者治愈率很低，惡性程度高且易轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，患者生存率較低[5]。NSCLC的發(fā)生發(fā)展涉及多基因參與調(diào)控的過程，從基因水平研究NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制越來越廣泛，研究顯示，多種lncRNA，如lncRNA ZEB2-AS1、LncRNA ANCR等在NSCLC中異常表達(dá)，與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。

lncRNA MNX1-AS1基因位于7號(hào)染色體，可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生992 bp的LncRNA，既往研究顯示，lncRNA MNX1-AS1在結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、三陰乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是腫瘤潛在治療靶點(diǎn)[7,8]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC癌組織與細(xì)胞系中表達(dá)水平升高，提示lncRNA MNX1-AS1表達(dá)與NSCLC發(fā)生有關(guān)，通過分析臨床病理特征顯示lncRNA MNX1-AS1表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA MNX1-AS1與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，lncRNA MNX1-AS1表達(dá)水平越高，患者預(yù)后較差，總生存率顯著降低，與報(bào)道結(jié)果類似[9]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤的一種惡性行為，研究顯示，lncRNA MNX1-AS1參與調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，如Wang等[10]研究表明，lncRNA MNX1-AS1通過miR-218-5p調(diào)節(jié)RAB1A的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，降低MNX1-AS1的表達(dá)可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Liu等[11]研究結(jié)果顯示，lncRNA MNX1-AS1通過靶向抑制miR-527表達(dá)，上調(diào)BRAF表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。本研結(jié)果顯示，在PC-9細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-MNX1-AS1后，PC-9細(xì)胞增殖活性、遷移與侵襲能力顯著下降，表明lncRNA MNX1-AS1參與NSCLC的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，與Liu等[11]人報(bào)道結(jié)果類似，提示lncRNA MNX1-AS1可能是治療NSCLC的標(biāo)志物。

PI3K/AKT通路在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，AKT的活化可激活mTOR，使mTOR的磷酸化水平提高，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡與能量代謝，PI3K/AKT/mTOR通路的激活與NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和耐藥密切相關(guān)[12]。多項(xiàng)報(bào)道顯示，lncRNA可通過影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，影響NSCLC細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥，從而參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展[13]。研究顯示，在NSCLC中，敲低lncRNA ROR1-AS1表達(dá)可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活，抑制NSCLC細(xì)胞的活力和侵襲能力，并抑制異種移植NSCLC腫瘤的生長[14]。在乳腺癌細(xì)胞中，lncRNA MNX1-AS1通過激活A(yù)KT/mTOR途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC-9細(xì)胞中抑制lncRNA MNX1-AS1表達(dá)后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明lncRNA MNX1-AS1可通過影響PI3K/AKT/mTOR途徑而調(diào)控NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，lncRNA MNX1-AS1在NSCLC中表達(dá)水平升高，通過激活PI3K/AKT通路影響NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展，但其具體作用機(jī)制尚仍需結(jié)合動(dòng)物模型做進(jìn)一步研究。