吳帥楠， 李召寶， 王建琪， 郭香君， 曹素敏， 林秀雅， 褚亞輝

(河北省滄州市中心醫(yī)院口腔門診， 河北 滄州 061000)

牙周炎是一種高度流行的慢性感染性疾病，可造成牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)的損壞，引起牙周附著喪失，牙齦萎縮，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)和脫落[1]。牙周炎的治療不僅包括局部炎癥的控制，還包括牙周組織的再生及重建其功能。干細(xì)胞療法是通過(guò)移植具有特異性修復(fù)組織潛能的細(xì)胞使有缺陷組織再生的一種方法[2]。人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織中的一組間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，可分化為牙骨質(zhì)形成細(xì)胞和成骨細(xì)胞等，是牙周組織再生的關(guān)鍵細(xì)胞。因此，研究PDLSCs成骨分化的機(jī)制有助于牙周組織再生的治療和研究。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是一種生長(zhǎng)因子，包括BMP2、BMP3、BMP4、BMP7、BMP8 和 BMP9等多種BMP，在骨誘導(dǎo)和骨維持中有重要作用，其有助于間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化[3]。BMP8B是其中重要一種，是骨代謝中重要的信號(hào)分子，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的產(chǎn)熱和能量平衡[4]，本研究通過(guò)體外分離并培養(yǎng)PDLSCs細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染BMP8B，探討B(tài)MP8B沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)PDLSCs細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑：α-MEM培養(yǎng)基(32561037)，美國(guó)Gibco公司；總RNA提取試劑盒(AM1830)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；L-抗壞血酸(A4403)、β-甘油酸鈉(G9422)、地塞米松(D4902)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(5091284001)、十二烷基硫酸鈉(SDS，71725)、茜素紅染色試劑盒(A5533)，美國(guó)Sigma-Aldrich；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(216213)，德國(guó)QIAGEN；兔源一抗BMP8B(P34280)，蘇州百遠(yuǎn)生物；Osterix(ab229258)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)(ab13420)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt - related transcription factor 2，Runx2)(ab76956)、單抗細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1，ab40754)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)(ab32147)、GAPDH(ab181602)、山羊抗兔IgG H&L(ab150079)，英國(guó)abcam；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C0038)、細(xì)胞蛋白提取試劑盒(P0033)、BCA蛋白定量試劑盒(P0012)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測(cè)試劑盒(P0321S)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(C0060)，北京索萊寶；BMP8B、Osx、OCN、Runx2 mRNA、BMP8B-shRNA、BMP8B-shRNA陰性對(duì)照、GAPDH，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。熒光倒置顯微鏡，日本Olympus；5424臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；多功能酶標(biāo)儀、Applied Biosystems PCR儀、蛋白凝膠成像儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2方 法

1.2.1PDLSCs分離與培養(yǎng)：2019年3月至2019年11月，收集河北省滄州市中心醫(yī)院口腔科的10例需正畸治療患者的第一、第二前磨牙，患者年齡為18～25歲，且無(wú)已知的牙周疾病，無(wú)吸煙史，無(wú)系統(tǒng)性疾病，近6個(gè)月無(wú)特殊服藥史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。從牙根中部1/3處分離牙周膜組織，加入I型膠原酶和分散酶II，37℃下消化1h，過(guò)濾細(xì)胞并獲得PDLSCs單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞加至含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出。當(dāng)接近90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第三代細(xì)胞用于后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)。

1.2.2集落形成試驗(yàn)：將1000個(gè)PDLSCs接種到直徑為10cm的含10%胎牛血清的培養(yǎng)皿中。10d后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，檢測(cè)細(xì)胞克隆情況，若50個(gè)或更多細(xì)胞的聚集體被認(rèn)為是細(xì)胞克隆。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析：將第三代PDLSCs培養(yǎng)在含有2%胎牛血清和磷酸鹽的FACS緩沖液中。然后加入以下抗體：MSC陽(yáng)性混合物(抗CD90-FITC、抗CD105-PerCP-Cy5.5、抗CD73-APC、抗CD44-PE)和PE陰性混合物(抗CD34-PE、抗CD45-PE、抗CD19-PE、抗CD11b-PE、抗HLA-DR-PE)。在此步驟之后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)，并用對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4PDLSCs細(xì)胞的成骨潛能和成脂誘導(dǎo)的檢測(cè)：成骨潛能檢測(cè)：將密度為2×105個(gè)/孔的PDLSCs接種于6孔板中，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50μg/mL維生素C、10 nmoL/L地塞米松、10mmoL/lβ-甘油磷酸酯)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天更換一次。培養(yǎng)28d后，用4%多聚甲醛固定30min，然后用2%茜素紅染色。成脂誘導(dǎo)檢測(cè)：在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、0.2mM消炎痛、2μM地塞米松、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.01mg/mL胰島素的α-MEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)2×105個(gè)PDLSCs/孔。28d后，細(xì)胞用油紅O染色并在顯微鏡下觀察。

1.2.5細(xì)胞分組及處理：轉(zhuǎn)染前24h，收集上述1.2.1中對(duì)數(shù)期PDLSCs細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種至含血清培養(yǎng)基的24孔板中。每孔細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔時(shí)，更換為不含血清的新鮮培養(yǎng)基，之后進(jìn)行慢病毒感染，將細(xì)胞分為對(duì)照組(僅添加新鮮培養(yǎng)基)、陰性轉(zhuǎn)染組(感染si-NC)、BMP8B沉默組(轉(zhuǎn)染BMP8B shRNA)和BMP8B過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染BMP8B siRNA)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：收集1.2.2中各組細(xì)胞，以6×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)3h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。

1.2.7ALP活性的檢測(cè)：收集1.2.2中各組細(xì)胞，以6×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，然后用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。然后用PBS洗滌，并用100μL裂解緩沖液(0.2% TritonX100)在冰上孵育2h。收集30μL裂解液進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。將30μL裂解液與20μL buffer和50μL底物在96孔板中37℃孵育10min。然后，加入100μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的吸光度。

1.2.8茜素紅染色法檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)：將各組PDLSCs細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，更換為含10%胎牛血清、抗壞血酸(50μg/mL)、β-甘油酸鈉(10mM)、地塞米松(10nM)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，95%酒精固定，1%茜素紅染料室溫孵育30min，PBS洗滌，隨機(jī)選取6個(gè)視野，顯微鏡下觀察細(xì)胞，礦化結(jié)節(jié)呈亮紅色。400μL 10%的十六烷基吡啶氯化銨加入至10mM磷酸鈉溶液中萃取PSLSCs中的茜素紅染料，使茜素紅染料從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中釋放，10min后，560nm處分光光度計(jì)測(cè)量PSLSCs細(xì)胞釋放的茜素紅，并進(jìn)行定量分析。

1.2.9實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)水平：RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95℃ 60s；變性 95℃ 30s，退火60℃ 45s；延伸72℃ 30s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.10蛋白免疫印跡(western blot，WB)法檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取1.2.5中誘導(dǎo)培養(yǎng)的各組細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行濃度檢測(cè)，蛋白樣品上樣到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳上，電泳結(jié)束后印跡到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉；分別加入一抗稀釋液(BMP8B、Osterix、OCN、Runx2、CyclinD1，均為1∶1000稀釋、CDK2為1∶5000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG H&L二抗稀釋液(1∶2000)，室溫孵育1h，TBST洗膜3次。GAPDH蛋白為內(nèi)參，蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1PDLSCs細(xì)胞鑒定：顯微鏡下觀察PDLSCs細(xì)胞為單核、多邊形或梭形(圖1A)，茜素紅染色結(jié)果顯示顯微鏡下可見(jiàn)紅色染色的礦化結(jié)節(jié)，證明PDLSCs具有成骨潛能(圖1B)。油紅O染色結(jié)果顯示有紅色的脂滴形成，證明PDLSCs具有成脂潛能(圖1C)。此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，獲得的細(xì)胞具有形成克隆的能力(圖1D，E)。流式細(xì)胞儀分析顯示，PDLSCs的MSC標(biāo)記(CD90、CD44、CD105、CD73)呈陽(yáng)性表達(dá)，而造血標(biāo)記(CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR)呈陰性表達(dá)(圖2)。

圖1 PDLSCs細(xì)胞鑒定注：A：PDLSCs的形態(tài)學(xué)特征；B：茜素紅染色；C：油紅O染色；D：結(jié)晶紫染色；E：PDLSCs的單個(gè)克隆的代表性圖像

圖2 PDLSCs的流式結(jié)果圖

2.2轉(zhuǎn)染后各組PDLSCs中BMP8B mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞BMP8B mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞BMP8B mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染后各組PDLSCs中BMP8B mRNA的表達(dá)(n=9)

2.3BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞增殖的影響：與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞增殖情況顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖情況顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 BMP8B表達(dá)對(duì)細(xì)胞PDLSCs細(xì)胞增殖的影響(n=9)

2.4BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞ALP活性的影響：與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞ALP活性顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞ALP活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞ALP活性的影響(n=9)

2.5BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響：與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞茜素紅染色程度顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞茜素紅染色程度顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖3。

圖3 BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響注：A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：BMP8B沉默組；D：BMP8B過(guò)表達(dá)組

表5 BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響(n=9)

2.6BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞中成骨標(biāo)記蛋白Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 BMP8B對(duì)PDLSCs細(xì)胞中成骨標(biāo)記Osterix OCN Runx2 mRNA表達(dá)的影響(n=9)

2.7BMP8B對(duì)PDLSCs增殖、成骨蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較和陰性轉(zhuǎn)染組相比，BMP8B沉默組細(xì)胞細(xì)胞CyclinD1、CDK2、Osterix、OCN、Runx2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，BMP8B過(guò)表達(dá)組細(xì)胞CyclinD1、CDK2、Osterix、OCN、Runx2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性轉(zhuǎn)染組比較，#P<0.05

圖5 BMP8B對(duì)PDLSCs增殖、成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：BMP8B沉默組；D：BMP8B過(guò)表達(dá)組

3 討 論

牙周炎是成人最常見(jiàn)的口腔疾病之一，也是牙齒損壞和掉落的主要原因之一，牙周炎會(huì)增加患者患心血管疾病等的風(fēng)險(xiǎn)[5]。其發(fā)病機(jī)理主要是由于細(xì)菌或其產(chǎn)物聚集在牙根或牙周組織表面，侵入牙周組織導(dǎo)致慢性炎癥，最終引起牙齒脫落。牙周炎治療最終目標(biāo)是恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和再生功能，應(yīng)用有利的種子細(xì)胞再生受損組織可能是牙周炎治療的有效方法[6]。PDLSCs具有分化為多種細(xì)胞類型并進(jìn)行穩(wěn)健的克隆的自我更新的潛力，在成骨相關(guān)激素、細(xì)胞因子或其他誘導(dǎo)劑作用下，PDLSCs可分化為骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞等，被認(rèn)為是牙周組織再生治療中的潛在干細(xì)胞群體。研究與PDLSCs增殖和分化有關(guān)的分子機(jī)制可能為PDLSCs細(xì)胞的成骨分化機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。本研究對(duì)PDLSCs細(xì)胞進(jìn)行分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析及成骨潛能和成脂誘導(dǎo)的檢測(cè)后表明，所分離細(xì)胞是PDLSC，具有干細(xì)胞特性。

BMP是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族成員，最初被鑒定為骨提取物中的骨誘導(dǎo)成分，BMP信號(hào)傳導(dǎo)是MSCs細(xì)胞成骨分化和骨形成調(diào)節(jié)的重要途徑之一[7]，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β家族成員BMP2具有促進(jìn)PDLSCs等細(xì)胞成骨分化的作用[8]。增殖是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，本研究結(jié)果顯示BMP8B過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)PDLSCs的增殖，沉默則抑制細(xì)胞增殖。ALP在細(xì)胞外基質(zhì)礦化過(guò)程中有重要的作用，是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物之一[9]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，BMP8B沉默或過(guò)表達(dá)均會(huì)影響細(xì)胞ALP活性和鈣化程度，表明BMP8B可能與細(xì)胞的PDLSCs增殖和成骨分化有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Runx2、Osterix通常被認(rèn)為是早期成骨分化的標(biāo)志，Runx2是MSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與不同階段成骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程[10]。Runx2通過(guò)參與調(diào)控成骨細(xì)胞分裂周期和ALP、OCN、I型膠原等成骨細(xì)胞分化成熟表型標(biāo)志物的表達(dá)并啟動(dòng)礦化[11]。Osterix是Runx2的下游信號(hào)傳導(dǎo)基因，也是是成骨分化過(guò)程必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究發(fā)現(xiàn)，BMP2/Runx2/Osterix信號(hào)通路通過(guò)參與成骨分化早期階段，促進(jìn)MSC的成骨分化[12]。OCN是由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨骼中最豐富的蛋白質(zhì)之一，主要在礦化過(guò)程中產(chǎn)生，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[13]。本研究qRT-PCR及WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默BMP8B會(huì)降低Osterix、OCN、Runx2表達(dá)，BMP8B過(guò)表達(dá)則促進(jìn)Osterix、OCN、Runx2水平，提示BMP8B可能通過(guò)影響成骨分化過(guò)程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而參與成骨細(xì)胞分化的過(guò)程，具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，BMP8B能夠影響PDLSCs細(xì)胞增殖和分化，BMP8B可能是成骨分化過(guò)程中的必要生物因子之一，是牙周炎治療的潛在研究方向。本研究?jī)H探討了BMP8B沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)體外細(xì)胞的影響，下一步需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討B(tài)MP8B在成骨分化中的可能作用和相關(guān)機(jī)制。