袁鑫怡，曾淑欣，楊潤，李羿

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610500）

中國每年女性乳腺癌發(fā)病率約7.7%，且病死率達8.12例/10萬[1]，目前已位列女性癌癥發(fā)病率首位。乳腺癌受多基因多靶點控制，發(fā)病機制復(fù)雜且不明確，晚期可出現(xiàn)多器官病變，威脅患者的生命。乳腺癌的治療手段多以放化療和根治性手術(shù)治療為主[2]，治療效果佳，但并發(fā)癥較多，且現(xiàn)有的治療乳腺癌的藥物毒副作用大，容易產(chǎn)生耐受性。因此，亟待尋找新的乳腺癌治療藥物。

蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz、堿地蒲公英Taraxracum borealisinense Kitam或同屬數(shù)種植物的干燥全草，含有黃酮類、多糖、萜類、酚類[3]等多種活性成分。現(xiàn)代研究表明，蒲公英黃酮通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1及TIMP-2的表達來抑制乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力[4]；蒲公英多糖通過促進P53和Bax蛋白表達、抑制B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達來誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，抑制其增殖[5]；蒲公英萜醇能夠顯著抑制T47D乳腺癌細胞增殖、遷移并可誘導(dǎo)其凋亡[6]。但這些研究多聚焦于單一或指標成分，而蒲公英抗乳腺癌的分子機制尚不明確，有待進一步深入研究。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性與中藥多成分、多靶點一致性的特點，預(yù)測蒲公英抗乳腺癌作用可能的作用靶點和作用通路，結(jié)合分子對接法驗證其結(jié)果的可靠性，為蒲公英臨床深入研究和資源開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 蒲公英活性成分和靶點的收集 在Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）里以“TARAXACUM MONGOLICUM”為檢索詞，以“Scorecutoff＞20，AdjustedP-value＜0.05”為條件，獲取蒲公英有效成分及其作用靶點信息，在TCMID數(shù)據(jù)庫（http：//47.100.169.139/tcmid/search/）以“PU GONG YING”為檢索詞篩選有效成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以“OB（%）≥30，DL（%）≥0.18”為條件獲取 TCMID 數(shù)據(jù)庫中符合條件的蒲公英有效成分及其作用靶點信息。以CancerHSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/CancerHSP.php）中的蒲公英有效成分及其靶點作為補充，檢索詞為“蒲公英”。

1.2 “有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1中得到的蒲公英有效成分和作用靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 乳腺癌靶點的收集及藥物-疾病靶點的獲取在 GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/Search/Keyword?queryString=Breast%20Carcinoma）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（db.idrblab.net/ttd/） 和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/home/）中以“Breast Carcinoma”為檢索詞收集乳腺癌相關(guān)靶點信息。在Malacards數(shù)據(jù)庫（https：//www.malacards.org）以“Breast Cancer”為檢索詞收集。在 Pharmgkb數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org）里沒有“Breast Carcinoma”和“Breast Cancer”的信息，因此以“Carcinoma，ductal，breast”為檢索詞收集乳腺癌相關(guān)靶點信息。蒲公英有效成分作用靶點與乳腺癌疾病靶點通過venny2.1.1在線數(shù)據(jù) 庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，得到蒲公英抗乳腺癌的相關(guān)基因。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 將1.3獲得的交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homosapiens”，參數(shù)Interactionscore設(shè)定為0.40，保存結(jié)果并對原始數(shù)據(jù)進行處理，分別建立network文件和type文件。將network文件和type文件信息依次導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)并進行參數(shù)設(shè)置和調(diào)整，運用CentiScaPe2.2計算得到Degree值、Betweenness值和Closeness值，在Excel中以“Degree＞8.05，BetweennessunDir＞40.00，ClosenessunDir＞0.01”為條件篩選關(guān)鍵靶點，最終獲得蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO和KEGG通路富集分析 將1.4中得到的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）， 依 次 點 擊 “Official-Gene-Symbol”和“GeneList”，物種選擇“Homosapicns”。上傳數(shù)據(jù)后進行KEGG通路富集分析，并從生物學(xué)過程BP（biologicalprocess）、細胞組分 CC（cellularcomponent）、分子功能MF（molecularfunction）3個方面進行GO分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel處理后導(dǎo)入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）作圖得到 GO分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

1.6 分子對接驗證 將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點作為受體，以“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的蒲公英活性成分作為配體，對兩者進行結(jié)合能力預(yù)測，結(jié)合能數(shù)值越低表明結(jié)合能力越好。在 uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）輸入關(guān)鍵靶點蛋白的基因名稱，查找得到靶點蛋白的uniprot號；在 RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中輸入靶點蛋白的uniprot號，找到相對應(yīng)的靶點蛋白并下載其2D結(jié)構(gòu)保存為pdb格式；導(dǎo)入pymol軟件進行去水和去配體操作，通過AntoDock軟件進行加氫處理并導(dǎo)出為pdbqt文件；通過PubChem下載蒲公英活性成分2D結(jié)構(gòu)并保存為sdf格式，通過OpenBabel轉(zhuǎn)換為pdb格式文件，利用AntoDock軟件進行檢測扭轉(zhuǎn)鍵和中心等預(yù)處理并導(dǎo)出為pdbqt文件；將pdbqt格式的配體和受體文件導(dǎo)入AntoDock軟件，并采用半柔性對接方法進行對接預(yù)測分析，分析結(jié)果通過Pymol進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英活性成分及其靶點 在Batman-TCM數(shù)據(jù)庫里得到蒲公英14種成分，其中6種沒有靶點數(shù)據(jù)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選了72種活性成分，只有5種活性成分符合條件，其中4種成分沒有目標信息，1種活性成分在CancerHSP數(shù)據(jù)庫進行篩選后得到。最后，總共獲得了10種活性成分，136個作用靶點，基本信息見表1。

表1 蒲公英活性成分及靶點Tab.1 Active ingredients and targets of dandelion

2.2 “有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 “有效成分-作用靶點”圖如圖1所示，圖中黃色代表藥物，紅色橢圓形代表作用靶點，綠色長方形代表有效成分，邊代表成分與靶點之間的關(guān)系。

圖1 “有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of“active ingredient-target of action”

2.3 乳腺癌靶點的收集及藥物-疾病靶點的獲取 利用GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、Pharmgkb、Malacards數(shù)據(jù)庫篩選得到1 856個乳腺癌疾病靶點；最終通過韋恩數(shù)據(jù)庫2.1.1得到蒲公英抗乳腺癌的41個可能作用靶點，詳細信息見圖2，靶點蛋白信息見OSID。

圖2 蒲公英活性成分靶點與乳腺癌相關(guān)靶點的韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of dandelion active ingredient target and breast cancer related target

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 將獲得的交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，通過Cytoscape3.8.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進行可視化，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖3和圖4。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含40個節(jié)點和161條邊，顏色由深到淺表示節(jié)點的度值由大到小，節(jié)點由大到小表示節(jié)點的度值由大到小。經(jīng)篩選得到重要的基因有ESR1、PPARG、PTGS2等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

圖4 核心靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Core target network

2.5 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對2.4中得到的10個關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，從BP、CC、MF 3個方面進行GO分析，共得到53條GO分析結(jié)果，按照P值大小進行GO分析柱狀圖的繪制，見圖5、圖6和圖7，柱越高代表涉及此過程的基因數(shù)目越多。其中P＜0.05的有47條GO分析結(jié)果，與BP有關(guān)的有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始過程、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、應(yīng)對雌二醇RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、前列腺形態(tài)發(fā)生中分支的調(diào)節(jié)等；與CC相關(guān)的有核染色質(zhì)、核漿、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細胞器膜等；與MF相關(guān)的有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等。KEGG分析共得到12條KEGG通路，按照P值大小進行KEGG通路分析氣泡圖的繪制，氣泡顏色越深代表涉及此通路與疾病的相關(guān)性程度越高，見圖7。其中P＜0.05的有6條KEGG通路，即癌癥通路、含血清素的神經(jīng)突觸、甲狀腺激素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的微小RNA、甲狀腺癌，主要涉及的靶點有 AR、RXRA、CASP3、PRKCA、PPARG、PTGS2、CASP3、RXRA 和 ESR1。

圖5 GO-BP柱狀圖Fig.5 GO-BP histogram

圖6 GO-CC柱狀圖Fig.6 GO-CC histogram

圖7 GO-MF柱狀圖Fig.7 GO-MF histogram

2.6 分子對接驗證 本研究將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點PTGS2、PPARG、ESR1與“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的蒲公英萜醇、蒲公英甾醇、七葉內(nèi)酯進行結(jié)合能力預(yù)測，靶點蛋白作為受體，活性成分作為配體。一般認為，當受體與配體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定時，其能量越低，產(chǎn)生的相互作用型越大[7]。根據(jù)對接結(jié)果可知，除了Taraxerol和PTGS2的結(jié)合能大于零以外，其余成分和靶點的結(jié)合能都小于零，說明大部分成分和靶點都具有良好的結(jié)合活性。其中Taraxerol和ESR1的結(jié)合能最低，結(jié)合能力最好；Taraxasterol和PTGS2、PPARG、ESR1的結(jié)合能都較低，結(jié)合能力較好；Esculetin和PTGS2、PPARG、ESR1的結(jié)合能都較低，結(jié)合能力較好。上述成分與關(guān)鍵抗乳腺癌靶點最佳對接結(jié)構(gòu)見圖8，全部對接結(jié)合能結(jié)果見表2。

圖8 KEGG氣泡圖Fig.8 KEGG bubble diagram

表2 分子對接結(jié)合能Tab.2 Molecular docking binding energy

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建蒲公英“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，通過多個數(shù)據(jù)庫篩選到10種活性成分和137個作用靶點，其中與乳腺癌相關(guān)的靶點有41個，涉及ESR1、PPARG、PTGS2等10個關(guān)鍵靶點，揭示了蒲公英抗乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制。分子對接結(jié)果顯示，蒲公英與抗乳腺癌靶點結(jié)合能較低，說明其有良好的抗癌活性。

蒲公英發(fā)揮抗乳腺癌作用的有效成分可能是蒲公英萜醇、蒲公英甾醇和七葉內(nèi)酯。研究表明，蒲公英萜醇通過誘導(dǎo)MCF-7細胞發(fā)生自噬，從而抑制細胞增殖，其機制可能與抑制mTOR信號通路有關(guān)[8]；蒲公英甾醇在腫瘤發(fā)展的多個階段均發(fā)揮了作用，包括抑制腫瘤發(fā)生、促進和誘導(dǎo)細胞分化，可以有效地抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]；七葉內(nèi)酯誘導(dǎo)涉及細胞凋亡的細胞毒性，其機制可能與降低線粒體膜電位、促進細胞色素c的釋放以及水解激活胱天蛋白酶-9/胱天蛋白酶-3的蛋白有關(guān)[10]。

為闡明蒲公英抗乳腺癌的機制，將PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的10個關(guān)鍵靶點通過GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的BP涉及激素代謝過程、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；CC主要涉及對核漿、核染色質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的調(diào)控；MF主要涉及DNA結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性等。GO富集分析發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的主要靶點有AR、RXRA、PPARG和ESR1。AR作為介導(dǎo)雄激素生物學(xué)效應(yīng)的細胞內(nèi)受體，可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路參與乳腺的發(fā)育，同時能調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖[11]；RXRA是配體依賴的核受體家族的重要成員，在炎癥反應(yīng)和代謝障礙中發(fā)揮重要作用，而乳腺癌特別是三陰型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應(yīng)[12]；PPARG可調(diào)節(jié)糖脂代謝、細胞分化、腫瘤細胞凋亡、炎癥、肥胖等[13]，研究發(fā)現(xiàn)PPARG激活可減弱腫瘤細胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[14]，PPARG作為抑癌基因在乳腺癌的腫瘤發(fā)生上起著關(guān)鍵作用，并且與乳腺癌患者總生存時間相關(guān)，研究表明PPARG可通過介導(dǎo)FABP4抑制乳腺癌的細胞生長、轉(zhuǎn)移及侵犯[15]；ESR1參與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的病理過程，它參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄信號通路及乳腺癌等婦科腫瘤細胞的增殖。

通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的通路主要是癌癥通路、癌癥中的微小RNA通路和甲狀腺激素信號通路等，涉及的主要靶點有CASP3、PRKCA和PTGS2。癌癥中的微小RNA可以在各類腫瘤和腫瘤組織異常表達，參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等[16]；甲狀腺激素可促進血管生成、抗細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[17]。CASP3編碼的蛋白質(zhì)是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在腫瘤細胞凋亡的執(zhí)行階段起著關(guān)鍵作用，通常被視作癌癥治療效果的標志物，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞利用凋亡過程產(chǎn)生有效的生長刺激信號，而活化的CASP3是細胞凋亡中的關(guān)鍵執(zhí)行者，參與生長刺激[18]。PRKCA屬于絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，可能與腫瘤細胞過度增殖相關(guān)，它參與多種細胞信號傳導(dǎo)途徑，在許多不同的細胞過程中發(fā)揮作用，如細胞黏附、細胞轉(zhuǎn)化、細胞周期檢查點和細胞體積控制等；PTGS2是環(huán)氧合酶-2（COX-2）的編碼基因，而COX-2是誘導(dǎo)型酶，可參與炎癥反應(yīng)、腫瘤細胞增殖和凋亡等多種病理過程[19]，PTGS2通過在乳腺癌中的過表達促進血管再生、腫瘤細胞的增殖和侵襲，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，Esculetin和PTGS2對接活性好，有效抑制了PTGS2的表達，可以預(yù)測為蒲公英治療乳腺癌的可能作用靶點。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法初步闡述了蒲公英抗乳腺癌的作用機制，通過對具有多成分、多靶點特點的蒲公英與乳腺癌復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究，闡述了蒲公英抗乳腺癌的有效成分、關(guān)鍵靶點、涉及的生物過程和通路，使“藥物-靶點”網(wǎng)絡(luò)可視化，為后續(xù)研究蒲公英抗乳腺癌提供了理論依據(jù)。

圖9 關(guān)鍵抗乳腺癌靶點和活性成分最佳對接圖Fig.9 Optimal docking diagram of key anti breast cancer targets and active ingredients